Фракционирование клеток U937 клеток в отсутствие высокоскоростной центрифуги
概要
Здесь мы представляем протокол изолировать плазматической мембраны, цитоплазмы и митохондрии клеток U937 без использования высокоскоростной центрифуги. Этот метод может использоваться для очистки субцеллюлярные фракций для последующего изучения белков локализации через immunoblotting.
Abstract
В этом протоколе мы подробно метод для получения субцеллюлярные фракций U937 клеток без использования ultracentrifugation или неизбирательного моющих средств. Этот метод использует гипотонический буферов, digitonin, механический лизис и дифференциального центрифугирования изолировать цитоплазмы, митохондрии и плазматической мембраны. Этот процесс может масштабироваться для удовлетворения потребностей исследователей, является недорогим и простым. Этот метод позволит исследователям для определения локализации белка в клетках без специализированных центрифуги и без использования коммерческих комплекты, оба из которых могут быть дорогими. Мы успешно использовали этот метод, чтобы отделить цитозольной, плазматической мембраны и митохондриальных протеинов в линии клеток человека Моноцит U937.
Introduction
Надежная идентификация белка локализации часто бывает необходимо при рассмотрении молекулярные пути в эукариотических клеток. Методы для получения субцеллюлярные фракции используются исследователями более внимательно изучить клеточных компонентов, представляющих интерес.
Большинство существующих методов фракционировки клетки, как правило, делятся на две широкие категории, на основе моющих средств1,2 и на основе ultracentrifugation3,4,5, который может быть различаются по скорости, точности и стоимости. Стиральный порошок на основе протоколов полагаются на использование буферов с увеличения моющая сила чтобы солюбилизировать последнего отдельных компонентов клетки. Это быстрый и удобный метод для обработки образцов и может быть экономически эффективным, если количество и размер образцов малы. Комплекты на основе моющих средств могут быть приобретены изолировать цитоплазмы, мембраны/органелл (смешанная дробь) и ядерных фракций из клеток. Однако некоторые недостатки, связанные с эти комплекты ограничивает их полезность для исследователей. Они предназначены для легко изолировать одного или двух компонентов клетки, но способны одновременно изолируя всех дробей от образца. Использование моющих средств означает, что будет одинаково солюбилизирован плазматической мембраны и мембраны закрытых органелл и, следовательно, не могут быть отделены друг от друга. Дополнительное усложнение возникает от несвободных компонентов в эти комплекты, препятствующая исследователей от изменения условий для конкретных приложений. Наконец они ограничены в число случаев использования и могут быть дорогими для больших масштабах экспериментов. Non-моющее средство на основе наборы для изоляции митохондрий существуют, однако, они не предназначены для изоляции плазматической мембраны и образец урожайность является значительно меньше, чем от плотности центрифугирования изоляции протоколы6,7 .
Методы, которые используют ultracentrifugation для получения фракций больше времени, но часто результат в чище фракций, чем наборы на основе моющих средств. Чтобы изолировать мембраны плазмы от клеток без первого растворяющие их (в результате загрязнения с Органеллы мембраны) требует от них лизированы методом без моющих средств, следуют разъединения клетчатых компонентов через дифференциальный центрифугирование — с изоляцией плазматической мембраны, требующие скорости 100 000 × g для выполнения. Во многих случаях дифференциального центрифугирования должны сопровождаться isopycnic плотность градиентного центрифугирования для дальнейшего разделения сотовой фракций или удаления загрязняющих веществ. Хотя эти методы являются тщательное и модифицируемый, недостатки включают стоимость, время потребления и потребность ультрацентрифуга для разделения фракций и дальнейшей очистки через плотность градиентного центрифугирования. Большинство Высокоскоростные центрифуги, ценой, что непомерно высока для отдельных следователей и часто разделяют, стержневое оборудование в академических учреждениях. Таким образом наличие ультрацентрифуга становится непомерно в таких ситуациях.
В этом протоколе фракционирование мы демонстрируем изоляции субцеллюлярные фракций без использования растворяющие моющие средства и высокая скорость центрифугирования. Этот метод позволит исследователям изолировать плазматической мембраны, митохондрии и цитоплазматических компонентов эукариотических клеток с минимальным загрязнением между фракциями.
Protocol
Representative Results
Discussion
В разработке этого протокола, обусловленные неспособность отделить митохондриальных и мембраны образцов, используя коммерчески доступные наборы для анализа белка локализации во время necroptosis14. Основная ограничения готовые комплекты являются их неспособность быть адапти…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Работа была поддержана низ 1R15HL135675-01 для Ларокка Тимоти Дж.
Materials
| Digitonin | TCI Chemicals | D0540 | For Cytoplasm Extraction |
| D-Mannitol | Sigma-Aldrich | M4125 | For Lysis buffer B |
| Dounce homogenizer | VWR | 22877-282 | For Homogenization |
| end-over-end rotator | Barnstead | N/A | For Cytoplasm Extraction |
| ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N',N'-tetraacetic acid (EGTA) | Alfa Aesar | J61721 | For Lysis buffer B |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E7889 | For Lysis buffer B |
| GAPDH (14C10) | Cell Signalling Technologies | 2118 | For detection of cytoplasmic fractions on western blot, dilution: 1:10000 |
| HEPES | VWR | J848 | For Lysis buffers A and B |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9541 | For Lysis buffer B |
| MgCl2 | Alfa Aesar | 12315 | For Lysis buffer B |
| Na, K-ATPase a1 (D4Y7E) | Cell Signalling Technologies | 23565 | For detection of plasma membrane fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | For Lysis buffer A |
| phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF) | VWR | M145 | For Cytoplasm Extraction and Homogenization Buffer |
| probe sonicator | Qsonica | Q125-110 | For Final Samples |
| Protease Inhibitor Cocktail, General Use | VWR | M221-1ML | For Cytoplasm Extraction |
| refrigerated centrifuge | Beckman-Coulter | N/A | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | VWR | 227 | For Sample buffer |
| sodium orthovanadate (SOV) | Sigma-Aldrich | 450243 | For Lysis buffers A and B |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | For Lysis buffer B |
| Tris-buffered Saline (TBS) | VWR | 788 | For Sample buffer |
| VDAC (D73D12) | Cell Signalling Technologies | 4661 | For detection of mitochondrial fractions on western blot, dilution: 1:1000 |
参考文献
- Baghirova, S., Hughes, B. G., Hendzel, M. J., Schulz, R. Sequential fractionation and isolation of subcellular proteins from tissue or cultured cells. MethodsX. 2, e440-e445 (2015).
- Hwang, S., Han, D. K. Subcellular fractionation for identification of biomarkers: Serial detergent extraction by subcellular accessibility and solubility. Methods in Molecular Biology. 1002, 25-35 (2013).
- Song, Y., Hao, Y., et al. Sample preparation project for the subcellular proteome of mouse liver. Proteomics. 6 (19), 5269-5277 (2006).
- Lenstra, J. A., Bloemendal, H. Topography of the total protein population from cultured cells upon fractionation by chemical extractions. European Journal of Biochemistry. 135 (3), 413-423 (1983).
- Michelsen, U., von Hagen, J. Chapter 19 Isolation of Subcellular Organelles and Structures. Methods in Enzymology. 463 (C), 305-328 (2009).
- Stimpson, S. E., Coorssen, J. R., Myers, S. J. Optimal isolation of mitochondria for proteomic analyses). Analytical Biochemistry. 475, 1-3 (2015).
- Williamson, C. D., Wong, D. S., Bozidis, P., Zhang, A., Colberg-Poley, A. M. Isolation of Endoplasmic Reticulum, Mitochondria, and Mitochondria-Associated Membrane and Detergent Resistant Membrane Fractions from Transfected Cells and from Human Cytomegalovirus-Infected Primary Fibroblasts. Current protocols in cell biology. 68, (2015).
- Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
- Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences. 76 (9), 4350-4354 (1979).
- Barber, R. D., Harmer, D. W., Coleman, R. A., Clark, B. J. GAPDH as a housekeeping gene: analysis of GAPDH mRNA expression in a panel of 72 human tissues. Physiological Genomics. 21 (3), 389-395 (2005).
- Hodge, T., Colombini, M. Regulation of metabolite flux through voltage-gating of VDAC channels. Journal of Membrane Biology. 157 (3), 271-279 (1997).
- Therien, a. G., Blostein, R. Mechanisms of sodium pump regulation. American journal of physiology. Cell physiology. 279 (3), C541-C566 (2000).
- Devarajan, P., Stabach, P. R., De Matteis, M. A., Morrow, J. S. Na,K-ATPase transport from endoplasmic reticulum to Golgi requires the Golgi spectrin-ankyrin G119 skeleton in Madin Darby canine kidney cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 94 (20), 10711-10716 (1997).
- McCaig, W. D., Patel, P. S., et al. Hyperglycemia potentiates a shift from apoptosis to RIP1-dependent necroptosis. Cell Death Discovery. 4, 55 (2018).
- Simpson, R. J. Homogenization of Mammalian Tissue. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (7), (2010).
