Деятельности на основе обучения на беговой дорожке с спинного мозга травмы крыс Вистара

Все методы, описанные были одобрены Университета Луисвилл институциональных животное уход и использование Комитет (IACUC). 1. до травмы, обработки и тестирования (одна неделя до SCI) Обрабатывать каждый Крыса в течение 5-10 мин один раз в день в течение пяти дней.Примечание: Взрослых самцов крыс Wistar, которые первоначально ~ 50 дней возраста и весят 200-225 g используются в настоящем Протоколе. Крысы на этот момент времени являются до травмы не приспособиться к упряжи, используемый для LT, как полное использование гомотерия позволяет крыса вырваться из пиджака. Проводить любые дотравматозному тестирования, исследование конкретных (например, авторы делают метаболические каркас оценок для исследований, которые включают эффекты SCI на функции мочевого пузыря и кишечника). 2. спинного ушиба25,26,27,28 Анестезировать животных с кетамин (80 мг/кг) и смесь Ксилазина (10 мг/кг) внутрибрюшинно согласно предоставленной дозировка диаграмма (Таблица 1). Администрирование, дополнительное дозирование по мере необходимости. Тест глубины анестезии по крайней мере каждые 10 мин путем оценки роговицы, глазной, педаль, щепотка хвост и Пинна рефлексов. Бритье волос из задней части животного, где разрез и травмы должны произойти. Очистите хирургические области с Dermachlor 4% хирургических скраб. Администрировать общий антибиотик пролонгированного (например, 0,5 мл подкожно Pro-Pen-G). Место наркотизированных животных на грелку на низкое значение для поддержания нормальной температуры тела. Определить местоположение целевого поражения уровня на основе позвоночного выступы и с помощью скальпеля #10, сделать надрез примерно 5 см на тыльной поверхности животного, непосредственно над срединной позвонков. Для середины грудной ушибы разоблачить T8/T9 уровень удаления спинного мозга через (с rongeurs) наплавки T7 позвоночной пластинки. С помощью устройства ушиб как бесконечный горизонт ударного29, выполнить ушиба (умеренной до тяжелой степени SCI, использовать силу 210 kdyn не время останавливаться)18. Шовные вместе мышечный слой и фасции над спинного мозга с помощью леска диаметром 4-0 и закрыть кожи с 9 мм хирургической раны клипов. Администрировать послеоперационных препаратов, таких как гентамицина сульфат (5 мг/кг в день в течение 5 дней, антибиотик, чтобы избежать инфекций мочевого пузыря) и мелоксикам (1 мг/кг подкожно, обезболивающее для первых 48 часов, а затем требуется). Место животных в чистой клетке на грелку. Проверьте животных признаки каждые 15 минут, до тех пор, пока они полностью проснуться от анестезии.  В первый день после операции животные, предлагается съесть с сладкие лечения. В течение первых 48 часов (см. три раза в день во время ручной crede – 2.10), крысы контролируются для бездействия, вокализации в ответ на обработку и отсутствие желания съесть и выпить.  Если анальгезии оказывается недостаточным, связался ветеринарного персонала. На протяжении всего этапа первоначального восстановления две недели животных наблюдаются доказательств инфекции или другие осложнения. Однажды рефлекса мочеиспускания возвращает, животные как правило, два раза в день (утром и вечером). Животные с инфекции или значительная потеря веса сразу умерщвлены. Что касается потребления продовольствия и воды, cut off точка для эвтаназии, когда животное достигла что-нибудь более 20% потеря веса. Нормальный вес потеря после хирургии и неиспользованием атрофия мышц ниже уровня травмы — 15-20%. Все животные весили по крайней мере один раз в неделю. Выполняют мочевого пузыря, опорожнения процедур с использованием ручной маневр Credé 3 раза в день (8 часов утра, 3 вечера, 10 вечера) до тех пор, пока функция рефлексивный мочевого пузыря вернулся (3-6 дней в среднем для ушибов)26,30. 3. Подготовка фаза Начаться не ранее, чем через две недели поста SCI, как инициатора мероприятий слишком рано может усиливать вторичные травмы каскады31LT. 1 неделя адаптационного беговая дорожка обучение: транспорт крыс в тихой комнате, предназначенный для обучения. На 1 день случайно и равномерно делят SCI животных на подготовку и не обучены контрольных групп, с учетом потенциальной изменчивости в себе травмы, а также степень спонтанного восстановления после ушиба. Например, разделить крыс на 4 отдельные группы: четвероногих подготовленных (QT), передних конечностей только обученные (FT), не обучены управления (NT) и не обучены дома Кейдж управления (HC). Шам группы, где животные получают ламинэктомии, но никаких повреждений и иным образом обрабатываются так же, как и другие группы могут также использоваться в качестве ранен контрольной группы без подготовки. Место каждого животного в соответствующих ремень (рис. 1) и пристегните ремни к механизму поддержки веса тела выше беговая дорожка через Аллигатор клипов, которые крепятся к вес поддержки пружины (рис. 2 и рис. 3). Это требует животное должно быть зафиксировано в одном месте на беговой дорожке, обеспечение того, что они идут в назначенный вперед направление и скорость.Примечание: Из-за нехватки времени и персонала, авторов Лаборатория проводит ежедневные тренировки в группах по двенадцати животных, три в каждой группе подмножества. Запустите процесс адаптационного после ранее опубликованного протокола17. Начать адаптационного LT (начало пост SCI 3 недели) с постепенным беговая дорожка воздействия режима, увеличивая от 10 мин на 1 день в полной целевой 58 мин в течение первой недели (Таблица 2). Как правило на 4 день, животные акклиматизироваться хорошо для режима обучения. Если животное не показывать прогрессии на третий день acclimation, время будет снижение и дополнительных дней, добавил в более постепенным рамп up (редко). Если животное во время в первый день или два не приспособятся к камере упряжи и беговая дорожка, остановить на тренировке, удалить его из ремня, место животных обратно в его клетке и дать ей два лечит, чтобы способствовать укреплению будущего соблюдения. Следующий день, место животного в системе поддержки упряжь и вес снова за 10 мин. В последующие дни увеличить продолжительность 20 мин первоначально, а затем продолжать увеличивать продолжительность тренировки ежедневно для достижения полного обучения на 10 день. Следуйте подробной тренировочный режим, приведены в таблице 2. Из-за использования ограниченных задних конечностей после травмы крысы в группе QT потребует руководство по упрощению процедур для надлежащего лапы размещения во время шагать на беговой дорожке. Используйте один палец на каждой руке (обычно третья цифра) для помощи в поддержку бедра/талии. Когда животное требует дальнейшей помощи в активизации, используйте этот же палец, чтобы применить давление выше колена начать шагать. При необходимости используйте отдельный палец (обычно пятая цифра) для помощи ног степпингом.Примечание: Количество необходимой поддержки веса тела варьируется от животных животных и меняется по ходу обучения. Система поддержки Весна дает достаточно помощи держать животное позиционируется для правильной походки. Дальнейшая поддержка предоставляется при необходимости тренер за выше. Обратите внимание, что ключевым элементом LT функционально соответствующие лапы размещение для активизации и координации, которые способствуют тренера и является независимой от системы поддержки interlimb. Для группы упражнений FT Отрегулируйте систему поддержки веса тела слегка поднять задних конечностей для обеспечения не сензорных стимулах к лапы и не несущие происходит через контакт с беговой дорожки.Примечание: FT группа служит упражнения и метаболического контроля, похож на рукоятки упражнения в человеческой деятельности на основе подготовки исследований. Группы NT запряженных и прилагается к системе поддержки веса тела таким же образом как QT и место группе NT возле группе QT на стационарных поверхности (рис. 2 и рис. 3).Примечание: NT группа получает без активности и элементы управления для любого потенциального воздействия используется в течение длительного времени. Дома Кейдж группа может служить в качестве дополнительного элемента управления. Транспортные этих животных для учебного центра в качестве дополнительного шага для этой группы. День 7 -10 после начала LT, поезд каждого животного, один раз в день, каждый день до дня прекращения исследования. После каждого дня обучения дать каждое животное сладких лакомство для укрепления соблюдения. По-прежнему ежедневно LT на животных после режима 1 h, приведены в таблице 2 в течение всего исследования (например, 8-12 недель, чтобы имитировать приблизительно 80 один час сессий, которые делаются в клинических исследованиях)9. 4. эвтаназии и коллекции тканей Применять летальная доза наркоза животного, что придерживается AVMA руководящие принципы эвтаназии. Когда сердце едва избиении, немедленно начнете сначала perfusing животное в выделенный Зонта с холодной гепаринизированным физраствора, следуют холодной, 4% раствор параформальдегида. Начать с помощью Ножницы хирургические сделать надрез через диафрагму, подвергая грудной полости. Продолжать прорваться через грудную клетку рострально с обеих сторон, удаление грудной клетки. Вставьте иглу перфузии в левый желудочек сердца и зажим иглы с hemostats, а затем клип правого предсердия. С помощью перфузионного насоса механизм, позволяют холодной гепаринизированным солевых течь через животного кровеносных сосудов. Раз ясно физиологическим потоков от правого предсердия, переключить сверх к холодной параформальдегида 4% раствор, пока не застыл тело. Удалить необходимые ткани, такие как почки, мочевого пузыря, толстой кишки, мозг, сенсорных ганглиев и спинного мозга и хранить в параформальдегида 4% на срок до 48 часов при 4 ° C. После 24-48 ч перемещение ткани в 30% сахарозы и хранить при 4 ° C. Перемещение, собранные ткани до 30% сахарозы фосфатные буферизуются криопротектора решение пока не будут готовы для резки ткани. Чтобы вырезать ткань, внедрить в комплексе замораживания тканей и разрезают на криостата на желаемую толщину в зависимости от типа ткани используется (например, 35 мкм для головного мозга и спинного тканей, 5-7 мкм для тканей органа).