척수와 디딜 방 아에 활동 기반 교육 부상 Wistar 쥐

설명 하는 모든 메서드는 루이빌 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 대학에 의해 승인 되었습니다. 1. 사전 부상 처리 및 테스트 (SCI 전에 1 주) 5 일 동안 하루에 한 번 5-10 분 동안 각 쥐를 처리 합니다.참고: 있는 나이의 50 일 처음 200-225 g의 무게는 성인 남성 Wistar 쥐가이 프로토콜에 사용 됩니다. 이 사전 부상 시간 포인트는 쥐 하지 LT hindlimbs의 전체 사용 수 재킷에서 쥐로 사용 되는 마구에 풍토에 순화. 연구 관련 그 어떤 사전 부상 테스트 실시 (예를 들어, 저자 할 대사 케이지 방광과 창 자 기능에 과학의 효과 포함 하는 연구에 대 한 평가). 2. 척수 타 박상25,26,,2728 동물 마 취 제 (80 mg/kg)와 xylazine (10 mg/kg) 혼합물 제공된 복용량 차트 (표 1)에 따르면 intraperitoneally anesthetize 필요에 따라 추가 투약 관리 합니다. 각 막, 종을, 페달, 꼬리 핀치, pinna 반사를 평가 하 여 마 취 깊이 매 10 분을 테스트 합니다. 절 개 및 상해는 발생 하는 동물의 뒤에서 머리를 면도. Dermachlor 4% 수술 스크럽으로 외과 영역을 깨끗 케. 긴-연기 일반 항생제를 관리 (예를 들어, 0.5 cc 프로 Pen G 피하). 정상적인 체온을 유지 하기 위해 낮은 설정에서 생리대에 마 취 동물을 놓습니다. 대상된 병 변의 수준의 #10 메스와 척추 돌기를 따라 기반으로 위치를 추정, 약된 5 cm 절 개 바로 위에 중간 선 척추 동물의 등에서. 중간에 흉부 타 박상, 척수를 통해 제거 (rongeurs)의 T8/T9 수준 overlaying T7 척추 lamina의 노출. 무한 한 지평선 충돌29, 등 타 박상 장치를 사용 하는 타 박상 (SCI의 심각한 정도에 적당 한 망설임 시간 210 kdyn의 힘을 사용) 수행18. 함께 근육 층과 근 막 4-0 직경 monofilament를 사용 하 여 척수를 통해 봉합 하 고 클립 미리 수술 상처와 피부를 닫습니다. 수술 후 마약, gentamicin 황산 (5 한 일 당 5 mg/kg, 방광 감염을 피하기 위해 항생제)와 meloxicam 관리 (1 mg/kg 피하, 진통제와 다음으로 첫 번째 48 h에 대 한 필요). 생리대에서 깨끗 한 장에 동물을 배치 합니다. 그들은 마 취에서 완전히 깨어 때까지 15 분 마다 동물 생체 신호를 확인 하십시오.  첫 번째 수술 후 하루 동안 동물은 설탕 치료와 함께 식사 하는 것이 좋습니다. 첫 번째 48 h에 대 한 (수동 crede-의 시간에 매일 세 번 2.10 참조), 쥐 비활성, 응답 처리, 그리고 음식과 음료 욕망의 부족으로 발성에 대 한 모니터링 됩니다.  진통은 적절 한 것을 발견 하 고, 수의 직원을 연결 합니다. 초기 2 주 회복 단계에 걸쳐 동물 감염 또는 기타 합병증의 증거에 대 한 관찰 된다. 한 번 voiding 반환 반사, 동물 (이른 아침과 늦은 오후) 하루에 두 번 하는 경향이 있다. 동물 감염 또는 중요 한 체중 감소는 즉시 안락사. 음식과 물 섭취 량에 대 한 안락사에 대 한 포인트 잘라 때 동물에 도달 했습니다 아무것도 이상의 20% 체중 감소. 상해의 수준 아래 근육의 수술과 폐기 위축 후 정상적인 체중 감량은 15-20%. 모든 동물 주 당 한 번 이상 무게를 달았다. 수동 Credé 책략 하루에 3 번 (8 오전, 오후 3 시, 오후 10 시)를 사용 하 여 프로시저를 비우는 방광을 수행 때까지 반사 성 방광 기능 (타 박상에 대 한 평균 3 ~ 6 일)26,30를 반환 했습니다. 3. 훈련 단계 LT 비행은 2 주 게시물-문화, 너무 일찍 2 차 부상 캐스케이드31을 악화 있습니다 시작 개입으로 시작. 디딜 방 아 훈련을 주 1 새 환경 순응: 훈련을 위한 전용 조용한 방에 쥐를 수송. 주 1, 균등 하 게 무작위로 박상 후 부상 자체 뿐만 아니라 자발적인 복구의 잠재적인 다양성을 훈련 하 고 훈련 비 제어 그룹으로 SCI 동물을 나눕니다. 예를 들어 쥐 4 별도 그룹으로 나누어: 네 발 훈련된 (QT), forelimb 전용 훈련된 (FT), 훈련 비 제어 (NT) 및 훈련 비 홈 케이지 제어 (HC). 동물에는 laminectomy 그러나 아무 상해도 받을 하 고 그렇지 않으면 같은 다른 그룹으로 처리 됩니다 가짜 그룹 훈련 없이 손상 되지 않은 컨트롤 그룹으로도 사용할 수 있습니다. 각각 하네스 (그림 1)에 각 동물을 놓고 마구 디딜 방 아를 통해 악어 클립 무게 지원 스프링스 (그림 2 및 그림 3)에 고정 되는 위에 몸 무게 지원 메커니즘에 고정 합니다. 이 디딜 방 아, 그들은 지정 된 앞으로 방향과 속도에 서 보장에 한 자리에 고정 될 동물을 필요 합니다.참고: 시간 및 인력 제약으로 저자의 연구실 12 동물, 각 하위 그룹에 3의 그룹에서 매일 훈련 실시. 이전에 게시 프로토콜17를 다음 새 환경 순응 과정을 시작 합니다. 첫 번째 주 (표 2) 58 분의 전체 대상 1 일에 10 분에서 증가 점진적 디딜 방 아 노출 처방, LT (주 3 게시물-과학의 시작)에 새 환경 순응을 개시. 일반적으로 하루 4, 동물 훈련 처방에 잘 적응. 동물 새 환경 순응의 세번째 날에 의해 진행 표시 되지 않으면, 시간 감소, 그리고 여분의 것 더 점진적 램프 업 (드문)에 추가 하는 일. 처음 하루 이틀 동안 동물 하네스 및 디딜 방 아의 감 금에 적응 하지 않습니다, 경우 훈련 세션을 중지, 마구에서 그것을 제거, 그것의 감 금에 있는 동물 뒤 배치 하 고 미래의 준수를 강화 수 있도록 두 취급 합니다. 다음 날, 다시 10 분에 대 한 마구 및 무게 지원 시스템에 동물을 놓습니다. 이후의 일에 처음 20 분 기간을 증가 다음 10 일 전체 교육을 달성 하기 위해 매일 훈련 기간을 증가. 표 2에 제공 된 상세한 훈련 식이요법을 따르십시오. 제한 된 뒷 다리 사용 후 부상으로 인해 QT 그룹에서 쥐 디딜 방 아에 스텝 하는 동안 적절 한 발 배치에 대 한 수동 활성화를 요구할 것 이다. 각 손 (일반적으로 3 자리)에 한 손가락을 사용 하 여 엉덩이/허리 지원에 도움이. 동물을 해야 할 경우 추가 지원을 강화이 동일한 손가락을 사용 하 여 스테핑 시작 무릎 위에 압력. 필요한 경우 별도 손가락 (일반적으로 5 자리)를 사용 하 여 스텝에 발을 도움이.참고: 필요한 몸 무게 지원 금액 동물 동물에서 변화 하 고 교육 진행으로 변경. 봄 지원 시스템 적절 한 걸음 걸이 대 한 배치 하는 동물 유지에 충분 한 지원을 제공 합니다. 위의 당 트레이너에 의해 필요에 따라 추가 지원이 제공 됩니다. LT의 핵심 요소는 기능적으로 적절 한 발 배치 스텝 interlimb 트레이너에 의해 추진 되 고 독립적인 지원 시스템의 조정 및. 피트 운동 그룹에 대 한 디딜 방 아와 접촉을 통해 발생 하는 발에 감각 자극이 없는 고 아무런 무게 베어링 되도록 뒷 다리 사지를 약간 상승 몸 무게 지원 시스템을 조정 합니다.참고: FT 그룹 운동 및 대사 제어, 인간의 활동 기반 교육 연구에서 손으로 크랭크 운동 비슷한 제공합니다. NT 그룹 무력화 있고 QT와 장소 (그림 2 및 그림 3) 고정 된 표면에 QT 그룹 근처 NT 그룹으로 비슷한 방식에서 몸 무게 지원 시스템에 연결 된.참고: NT 그룹 활동 및 오랜된 시간 동안 무력화 되 고 잠재적으로 미치는 영향에 대 한 제어를 받습니다. 홈 케이지 그룹 추가 컨트롤로 사용할 수 있습니다. 이 그룹에 대 한 추가 단계 훈련 시설에이 동물을 전송 합니다. 하루 7-10, LT의 시작 다음 기차 일단 매일 각 동물, 연구의 종료 날까지 매일. 훈련의 매일, 다음 각 동물 규정 준수를 강화 하기 위해 설탕 치료를 제공 합니다. 표 2 에 연구 기간 (예를 들어,는 대략 80 1 시간씩 임상 연구에서 수행을 모방을 8-12 주)에 대 한 제공 1 h 처방에 따라 동물에 매일 LT를 계속9. 4. 안락사와 조직 컬렉션 동물 안락사에 AVMA 지침을 준수 하는 마 취의 치명적인 복용량을 관리 합니다. 심장 박동 겨우 즉시 감기, 4 %paraformaldehyde 솔루션 다음 차가운 heparinized 염 분으로 먼저 전용된 증기 두건에서 동물을 perfusing 시작. 횡 경 막, 흉 강에 노출에서 절 개를 만들기 위해 수술가 위를 사용 하 여 시작 합니다. 양쪽 모두, 흉 곽을 제거 rostrally 흉 곽을 통해 잘라 계속 합니다. 심장의 좌 심 실에 관류 바늘을 삽입 하 고 바늘 hemostats와 함께 클램프 다음 클립 오른쪽 아 트리 움. 관류 펌프 메커니즘을 사용 하 여, 동물의 혈관을 통해 흐르는 차가운 heparinized 염 분을 수 있습니다. 오른쪽 아 트리 움에서 분명 한 번 식 염 수 흐름 바꿀 찬 4 %paraformaldehyde 솔루션, 몸은 굳 어 때까지. 신장, 방광, 결 장, 뇌, 감각 중추, 척수, 등 필요한 조직을 제거 하 고 최대 48 h 4 ° c.에 대 한 4 %paraformaldehyde 저장 24-48 h 후 30% 자당을 4 ° c.에 게 조직 이동 30% 자당/인산을 수집된 조직 버퍼링 cryoprotectant 솔루션 조직 절단에 대 한 준비가 될 때까지 이동 합니다. 잘라 조직, 조직 얼어 화합물에 포함 하 고 조직 사용 (예를 들면, 두뇌 및 척수 조직, 장기 조직에 대 한 5-7 µ m 35 µ m)의 종류에 따라 원하는 두께 cryostat에 잘라.