脊髄とトレッドミル上のアクティビティ ベースのトレーニング負傷 Wistar ラット

記載されているすべてのメソッドは、ルイビル機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の大学によって承認されています。 1. 中古損傷処理とテスト (SCI の前に 1 週間) 5 日の日に 1 回 5 ~ 10 分の期間の各ラットを処理します。注: 〜 50 日齢は、最初、200 225 g の重量を量る雄 Wistar ラットは、このプロトコルで使用されます。この中古損傷時点でラット後肢の完全な使用ができますジャケットから脱出するラット LT 用ハーネスに慣れない。 テストを実施、中古損傷研究固有である (例えば著者は SCI の膀胱と腸の機能に及ぼす影響を含む研究用代謝ケージ評価)。 2. 脊髄挫傷25,26,27,28 ケタミン (80 mg/kg) と腹腔内指定された投与量の表 (表 1) によるとキシラジン (10 mg/kg) の混合物を持つ動物を麻酔します。必要に応じて補足注入を管理します。麻酔深度ごとに、少なくとも 10 分をテストするには、角膜、眼瞼、ペダル、尾ピンチと耳介反射を評価します。 切開と傷害が発生することが動物の背中の毛を剃る。Dermachlor 4% 手術時手洗いと外科の領域を浄化します。長時間作用型の一般的な抗生物質を管理 (例えば、0.5 cc プロ ペンアンド G 皮下)。 正常な体温を維持するために低の設定で加熱パッドに麻酔下の動物を配置します。 #10 メスと椎骨の突起に基づく対象病変のレベルの位置を推定、正中線の脊椎の上に直接、動物の背に推定 5 cm 切開を行います。 半ば胸部挫傷、オーバーレイする T7 椎弓板の (rongeurs) の除去を介して脊髄の T8 T9/レベルを公開します。 無限の地平線インパクター29の場合などの挫傷デバイスを使用して実行、挫傷 (SCI の深刻な程度に穏健派は、滞留時間がないと 210 kdyn のフォースを使用)18。 4-0 径モノフィラメントを使用して脊髄を一緒に筋層と筋膜を縫合し、クリップ 9 mm 外科創傷と皮膚を閉じます。 ゲンタマイシン硫酸塩 (5 mg/kg/日 5 日間; 膀胱感染症を避けるために抗生物質)、メロキシカムなど、術後の薬を管理 (1 mg/kg 皮下、最初の 48 時間、その後としては鎮痛剤が必要)。 加熱パッドできれいなケージに動物を配置します。麻酔から完全に目を覚ましているまで 15 分おきに動物のバイタル サインを確認します。 手術後の最初の日中に、動物が甘い御馳走を食べることをお勧めします。最初の 48 時間 (手動二 – の時に毎日 3 回は 2.10 参照)、ラットが非アクティブ、処理、および飲食の欲求の欠乏への応答で発声の監視します。 鎮痛が不十分である場合、獣医のスタッフに連絡が。初期 2 週間回復フェーズを通して動物は感染症や他の合併症の証拠を観察しました。一度排尿を返しますを反射、動物が一日二回 (朝と夕方) する傾向があった。感染症または有意な体重減少を持つ動物はすぐに安楽死させた。食料や水の摂取量について安楽死のためのポイントをオフにカットは動物に達したとき何も以上 20% 減量します。傷害のレベルの下の筋肉の手術と廃用性萎縮後の通常の重量損失は、15-20% です。すべての動物が週 1 回以上重量を量った。 手動 Credé 演習一日 3 回 (8, 15, 22) を使用してプロシージャを空にする膀胱を実行再帰膀胱機能が返さ (打撲傷の平均で 3-6 日)26,30まで。 3. トレーニング フェーズ 以前よりも 2 週間ポスト-SCI、開始の介入はあまりにも早く二次傷害カスケード31を悪化させるかもしれない、LT を開始します。 トレッドミル トレーニング週 1 順化: 訓練のために専用されている静かな部屋にラットを輸送。 1 日目、無作為かつ均等に SCI 動物訓練され、訓練を受けた非コントロール グループに分割挫傷後自発の回復の程度と同様、両方の損傷自体の変化の可能性を考慮します。たとえば、ラットを 4 つのグループに分ける: 四足歩行訓練を受けた (QT)、前肢だけ訓練された (フィート)、非訓練制御 (NT) と非訓練ホーム ケージ制御 (HC)。偽のグループの動物が、椎弓切除術がない傷害を受けるし、他のグループと同じ扱わは、トレーニングなし無傷制御グループとしても使用できます。 それぞれのハーネス (図 1) で各動物を置き、重量サポート スプリング (図 2 および図 3) に固定されているアリゲーター クリップを介してトレッドミル上本体重量支持機構にハーネスを固定します。これは動物をトレッドミルでは、指定された順方向とスピードで行くことを確実に 1 つのスポットで固定する必要があります。注: 時間と人員の制約のため筆者らの研究室は 12 の動物は、各サブセット グループの 3 つのグループで毎日トレーニングを行っています。 次の以前に発行されたプロトコル17風土順化プロセスを開始します。LT (第 3 週のポスト-SCI の開始) (表 2) の最初の週に 1 日目に 10 分から 58 分の完全なターゲットに増加トレッドミルの漸進的な露出療法と順化を開始します。通常、一日 4 動物は訓練の養生法によく順応します。時間は削減され、余分ななる動物馴化の 3 日目の進行が表示されない場合より緩やかな傾斜の (まれ) で追加された日。 最初の一日か二日の間に動物は、ハーネスとトレッドミルの閉じ込めには適応しない場合、トレーニング セッションを停止、ハーネスから削除、そのケージの裏では動物を配置、それを今後の準拠を強化するために 2 つの御馳走を与えます。次の日は、10 分のために再度ハーネスと重量のサポート システムに動物を配置します。日以降当初 20 分まで期間を延長し、10 日目に完全なトレーニングを達成するために毎日のトレーニング期間を増加し続けます。 表2 詳細な訓練の養生法に従ってください。 限られた後肢使用後負傷のため QT 群ラットは、トレッドミルでステップ実行しながら適切な足の配置に円滑化マニュアルを必要があります。ヒップ/腰サポートを支援する (通常は 3 桁) それぞれの手に 1 本の指を使用します。動物は、さらにステップで援助を必要とする場合は、ステップ実行を開始する膝の上の圧力を適用するこの同じ指を使用します。必要に応じて、ステップに足を支援するために別の指 (通常 5 桁) を使用します。注: 必要なボディの重量をサポートの量は動物から動物への変化し、トレーニングが進むにつれて変更します。スプリング サポート システムは、動物の適切な歩行のための位置を保つために十分な援助を提供します。さらにサポートは、上記あたりのトレーナーが必要に応じて提供されます。LT の重要な要素であるステップの機能適切な足の配置に注意してください interlimb トレーナーによって促進される、独立支援システムの調整と。 フィート運動のグループ、少しトレッドミルとの接触を介して足に感覚的な刺激と重量とは何ら関係が発生していないことを確認する後肢を昇格する本体重量サポート システムを調整します。注: FT グループは、運動と代謝制御、人間活動ベースのトレーニング研究のハンド クランク運動のような提供しています。 NT グループを活かした、QT および場所 (図 2 および図 3) 静止した表面に QT グループ近く NT グループとして同様の方法でボディ重量サポート システムに接続されています。注: NT グループを受け取りますないアクティビティと拡張された期間のために活かされているの任意の潜在的な効果のためのコントロール。 ホーム ケージ グループは、付加的な制御として使用できます。このグループの追加ステップとしてトレーニング施設にこれらの動物を輸送します。 7 日目で-10 LT の開始位置に続く鉄道それぞれの動物は 1 日 1 回、毎日研究の終了の日まで。各トレーニングの翌日、それぞれの動物にコンプライアンスを強化するための甘い御馳走を与えます。動物の研究 (例えば、臨床試験で行われる 80 の 1 時間のセッションをおおよそ模倣する 8-12 週) の期間については表 2の提供 1 h 療法を次に毎日の LT を続ける9。 4. 安楽死とティッシュのコレクション 安楽死の AVMA のガイドラインに準拠している動物に致死量の麻酔を管理します。 心臓がぎりぎりと冷たいヘパリン生食液冷、4% パラホルムアルデヒド溶液に続いて専用ドラフトで動物をまず灌直ちに開始します。 胸腔内の公開、横隔膜切開を作成する手術用ハサミを使用して開始します。胸部を取り外し、両側に吻方胸部をカットし続けます。心臓の左心室に血針を挿入し、止血剤、針をクランプ、クリップの右のアトリウム。 灌流ポンプ機構、動物の血管を通過する冷たいヘパリン生理食塩水を使用します。からだがこわばってまで、右心房から一度明確な生理食塩水の流れが冷たい 4% パラホルムアルデヒド ソリューションに切り替えます。 腎臓、膀胱、大腸、脳、感覚神経節、脊髄などの必要な組織を削除し、4 ° C で最大 48 時間 4% パラホルムアルデヒドに格納24-48 時間後 30% ショ糖と 4 ° C で保存場所に組織を移動します。 30% スクロース/リン酸に収集した組織は組織切削の準備が整うまで各種凍害保護ソリューションをバッファーに移動します。組織を切り取り、組織凍結化合物に埋め込むし、組織の使用 (例えば脳と脊髄の組織を臓器組織の 5-7 μ m の 35 μ m) の種類に応じて所望の厚さのクライオスタットのカットします。