脊髓损伤 wistar 大鼠跑步机的作业训练

所述的所有方法都已得到路易斯维尔大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。 1. 损伤前处理和检测 (sci 前一周) 每天处理每只老鼠 5-10分钟, 每天一次, 为期5天。注: 本协议中使用的是最初年龄约50天、体重200-225 克的成年雄性 wistar 大鼠。在受伤前的时间点上的老鼠没有适应 lt 使用的线束, 因为充分使用后肢可以让老鼠从夹克中逃脱。 进行任何特定于研究的损伤前测试 (例如, 作者对涉及 sci 对膀胱和肠道功能影响的研究进行代谢笼评估)。 2. 脊髓连接25、26、27、28 根据提供的剂量图 (表1), 用氯胺酮 (80 mgkg) 和 xylazine (10mg源于 kg) 在腹腔内对动物进行麻醉。根据需要管理补充剂量。通过评估角膜、眼睑、踏板、尾部夹紧和羽鼻反射, 至少每10分钟测试一次麻醉深度。 从发生切口和损伤的动物背部剪发。用皮草4% 手术擦洗清洁手术区域。使用长效普通抗生素 (例如, 0.5 cc 亲 pen-g 皮下注射)。 将麻醉后的动物放置在较低的加热垫上, 以保持正常体温。 根据椎体突起和 #10 手术刀估计目标病变水平的位置, 在动物的背上进行估计5厘米的切口, 直接在中线椎体上方。 对于胸腔中挫伤,通过切除 (含 t7 椎板) 的 t8t9 水平的脊髓。 使用挫伤装置, 如无限地平线撞击器29, 执行挫伤 (对于中等至严重程度的 sci, 使用 210 kdyn 的力量, 没有停留时间)18。 使用4-0 直径的单丝将脊髓上的肌层和筋膜缝合在一起, 并用9毫米手术伤口缝合皮肤。 术后服用硫酸庆大霉素 (每天 5 mg kg, 为期 5天; 避免膀胱感染的抗生素) 和美洛昔康 (皮下1 mg/kg, 先48小时镇痛, 然后根据需要)。 将动物放在干净的笼子里, 放在加热垫上。每15分钟检查一次动物生命体征, 直到它们从麻醉中完全清醒。 在术后的第一个日子里, 鼓励动物吃含糖的食物。在前 48小时 (在手工创作时每天三次—-见 2.10), 对老鼠进行不活动、在处理时发声以及缺乏吃喝欲望的监测。 如果发现镇痛不足, 请与兽医人员联系。在最初的两周恢复阶段, 观察动物感染或其他并发症的证据。一旦反射排尿返回, 这些动物往往每天两次 (清晨和下午晚些时候)。感染或体重显著下降的动物立即被安乐死。关于食物和水的摄入, 安乐死的截止点是动物体重下降超过 2 0% 的时候。正常体重减轻手术后和不使用萎缩的肌肉低于受伤水平是15-20。所有动物每周至少称重一次。 每天3次使用手动微管机动 (上午 8点, 下午 3点, 晚上 10点) 进行膀胱排空手术, 直到反身膀胱功能恢复 (平均3-6天的挫伤)26,30。 3. 培训阶段 在 sci 后两周内开始 lt, 因为过早启动干预可能会加剧继发性损伤级联 31. 第1周适应跑步机训练: 将老鼠运送到专门用于训练的安静房间。 在第一天, 随机和均匀地将 sci 动物分为训练和未训练的对照组, 以考虑损伤本身的潜在变异性以及挫伤后的自发恢复程度。例如, 将老鼠分成4组: 四足训练 (qt)、前肢训练 (ft)、未经训练的控制 (nt) 和未训练的家庭保持架控制 (hc)。动物接受椎板切除术但没有受伤, 否则处理方式与其他组相同的假组, 也可以在没有训练的情况下作为未受伤的控制组使用。 将每只动物放置在各自的线束中 (图 1), 并通过紧固在重量支撑弹簧上的鳄鱼夹将线束固定在跑步机上方的体重支撑机构上 (图2和图 3)。这就要求动物固定在跑步机上的一个位置, 确保它们朝着指定的前进方向和速度前进。注: 由于时间和人员的限制, 作者的实验室每天对12只动物进行培训, 每个子集组有3只动物。 按照以前发布的协议17开始适应过程.开始适应 lt (sci 后第3周开始), 逐步采用跑步机暴露方案, 从第1天的10分钟增加到第一周58分钟的全部目标 (表 2)。通常情况下, 到第4天, 动物很好地适应了训练方案。如果动物在适应的第三天还没有显示出进展, 时间就会缩短, 额外的天数会在更渐进的情况下增加 (罕见的情况)。 如果动物在第一天或两天内不适应线束和跑步机的限制, 停止训练, 将其从马具中取出, 将动物放回笼子里, 并给予它两种食物, 以帮助加强未来的依从性。第二天, 将动物再次放置在马具和重量支撑系统中 1 0分钟。在随后的日子里, 最初将训练时间延长 20分钟, 然后继续每天增加训练时间, 以便在第10天之前完成全面培训。 按照表 2中提供的详细培训方案进行操作。 由于损伤后后肢使用有限, qt 组的大鼠在踩在跑步机上时需要人工协助进行适当的爪子放置。每只手使用一个手指 (通常是第三个数字) 来帮助支撑腰部。当动物在步进方面需要进一步的帮助时, 用同样的手指在膝盖以上施加压力, 开始踩。如有必要, 使用单独的手指 (通常是第五位数字) 来帮助脚踩。注: 所需的体重支持量因动物而异, 并随着训练的进行而变化。弹簧支撑系统提供了足够的帮助, 使动物能够获得适当的步态。培训员根据上述要求提供进一步支助。请注意, lt 的一个关键要素是功能上适合步进和肢体间协调的爪子放置, 该位置由培训师推动, 独立于支持系统。 对于 ft 运动组, 调整体重支持系统, 使后肢稍微抬起, 以确保没有感觉刺激爪子, 也不因与跑步机接触而产生负重。注: 英国《金融时报》组作为一种运动和代谢控制, 类似于基于人类活动的培训研究中的手摇运动。 以与 qt 类似的方式将 nt 组利用并连接到体重支持系统, 并将 nt 组放置在固定表面的 qt 群附近 (图2和图 3)。注: nt 组在较长时间内被利用时没有收到任何活动和控件。 家庭笼子组可以作为一个额外的控制。将这些动物运送到训练设施, 作为这一群体的额外步骤。 在 lt 开始后的第7-10 天, 每天对每只动物进行一次训练, 直到研究结束的那一天。在每天的训练之后, 给每只动物一个含糖的治疗, 以加强依从性。在研究期间, 继续每天对动物进行 lt, 方法是遵循表 2中提供的1年方案 (例如, 8-12, 以模拟临床研究中进行的大约80小时的疗程)9。 4. 安乐死和组织收集 对坚持 avma 安乐死指南的动物进行致命剂量的麻醉。 当心脏刚刚跳动时, 立即开始在专用的烟罩中使用冷的肝素盐, 然后是冷的、4% 的甲醛溶液, 以此为原料。 开始使用手术剪刀在横隔膜上做一个切口, 露出胸腔。继续从两边的胸腔进行切割, 取出胸腔。将灌注针插入心脏的左心室, 用止血器夹住针头, 然后夹住右心房。 使用灌注泵机制, 让冷肝素盐水流经动物的血管。一旦清盐水从右心房流出, 切换到冷的4% 的甲醛溶液, 直到身体变硬。 去除必要的组织, 如肾脏、膀胱、结肠、大脑、感觉神经节和脊髓, 并在4°c 下以4% 的甲醛储存长达48小时。24-48小时后, 将组织移动到30% 的蔗糖, 并在4°c 下保存。 将收集到的组织转移到30% 的磷酸蔗糖缓冲低温保护剂溶液中, 直到组织准备好切割。要切割组织, 请将其嵌入组织冷冻化合物中, 并根据所使用的组织类型在所需厚度下切割在低温恒温器上 (例如, 大脑和脊髓组织为 35μm, 器官组织为5-7 微米)。