Burada, tasarım ve parçalanabilir taşıyıcıları için sinir büyüme faktörü (NGF) olarak nanostructured gözenekli silisyum (PSI) filmleri imal için bir protokol mevcut. Nöronal farklılaşma ve PC12 hücreleri ve fareler dorsal kök gangliyon (DRG) nöronlar akıbet üzerine tedavi NGF yüklü PSi taşıyıcıları ile karakterizedir.
Rağmen NGF büyük potansiyeli nörodejeneratif hastalıkların tedavisi için tedavi edici, yönetim protein kimyasal özelliklerine borçlu kan – beyin bariyerini çapraz değil gibi önemli bir sorun temsil eder ve bu nedenle uzun süreli gerektirir biyolojik bir etkiye sahip beyin teslim. Bu işi nanostructured PSi filmleri imalatı NGF parçalanabilir taşıyıcıları bu hassas protein sürekli teslimat için olarak tanımlar. PSi taşıyıcılar özellikle yüksek yükleme etkinliği ve sürekli serbest bırakmak-in NGF onun biyolojik aktivitesi koruma sırasında dört haftalık, bir süre için elde etmek için tasarlandı. NGF-PSi taşıyıcıların NGF teslim sistemi olarak incelenen vitro nöronal farklılaşma ve PC12 hücreleri ve Disosiye DRG nöronlar akıbet ikna etmek için onların yeteneği inceleyerek bir davranıştır. Hücre canlılığı temiz ve NGF yüklü PSi taşıyıcıları huzurunda değerlendirilir. PSi taşıyıcıları serbest NGF bioactivity tekrarlayan ücretsiz NGF idareleri konvansiyonel tedavi için karşılaştırılır. PC12 hücre farklılaşması analiz ve farklılaştırılmış hücrelerin üç farklı morfolojik parametreleri ölçüm tarafından karakterize; (i) (II toplam neurites uzunluğu ve (iii) dallanma noktası sayısını soma ayıklama neurites sayısı. PC12 hücreleri NGF-PSi gemileri ile tedavi yayın süresi boyunca derin bir farklılaşma göstermektedir. Ayrıca, DRG nöronal hücreleri NGF-PSi gemileri ile kültürlü bir geniş neurite inisiyasyon nöronların benzer tekrarlayan ücretsiz NGF idareleri ile tedavi gösterir. Okudu tunable taşıyıcıları nörodejeneratif hastalıklar için tedavi edici bir potansiyel uzun vadeli implantlarda NGF sürülmesi göstermektedir.
NGF geliştirilmesi ve periferik sinir sistemi (PNS)1 nöronlarda bakımı için önemlidir ve merkezi sinir sistemi (MSS)2‘ hayatta kalma ve fonksiyon bazal ön kolinerjik nöronların önemli bir rol oynar. Alzheimer ve Parkinson gibi merkezi nörodejeneratif hastalıkların tedavisi için yüksek farmakolojik potansiyel yaygın olarak, klinik çalışmalarda Şu anda devam eden3,4,5ile kanıtlanmıştır, 6. En büyük sorun NGF dağıtımını MSS için onun yetersizlik cross kan beyin bariyerini için (BBB) Sistemik yönetilen zaman,7bulunur. Ayrıca, hızlı enzimatik yıkımı NGF duyarlılık onun kısa yarılanma işler ve onun terapötik kullanım8,9önemli ölçüde sınırlar. Bu nedenle, güvenli bir şekilde NGF uzun süreli ve kontrollü yayın için izin teslim sistem tasarımı için karşılanmamış bir meydan okuma. Polimer esaslı sistem, dahil olmak üzere çeşitli NGF teslim sistemleri eğitimi10,11,12,13,14,15, olmuştur 16 , 17. bu sistemlerin yayın profilleri kez nerede ikinci aşamasında yayın oranı ilk seri çekim11 ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde düşük bir yavaş sürekli yayın tarafından takip ayrı bir ilk patlama ile karakterize ,18,19. Ayrıca, kapsülleme işlemi sırasında (Örneğin, poly(lactic-co-glycolic) asit) polimerlerin asidik bozulması ürünlerle veya NGF bioactivity kaybı protein inactivation ile bu sistemleri20gözlendi.
Nanostructured PSi, yüksek yüzey alanı, geniş gözenekli birim, biyouyumluluk ve akort çözünebilirlik vücut sıvısının içinde de dahil olmak üzere çeşitli çekici özellikler bir gelecek vaat eden uyuşturucu dağıtım platformu21içinpredestining ile karakterize, 22,23,24,25,26,27,28. Anodization koşulları uygun seçim kolayca uyuşturucu yükleme ve yayın kinetik21,27dikme için PSi yapısal özelliklerini (Örneğin, porozite ve gözenek boyutu) ayarlamak için izin verir. Ayrıca, çeşitli uygun kimyasal yollar PSi yüzeyine değiştirmek ve bununla daha fazla Si iskele fizyolojik koşullar altında çözünme hızı ve uyuşturucu22,24yayın oranları ayarlamak için izin vermek, 29,30.
Bu eser bir PSi tabanlı iletim sistemi için uzun süreli kontrollü serbest bırakmak-in NGF tasarlama üzerinde duruluyor. Nöronal farklılaşma ve akıbet NGF-PSi taşıyıcıları etkisi PC12 hücreleri kullanarak incelenir ve DRG nöronlar ayrışmış. Biz neurite çıkıntı ve tek bir yönetim içinde 1 aylık yayın süresi boyunca derin farklılaşma inducing tarafından yüklenen NGF onun bioactivity korudu göstermek.
Parçalanabilir nanostructured PSiO2 film fabrikasyon ve taşıyıcıları için onun sürekli ve uzun süreli yayın için izin ederken onun biyolojik aktivitesi koruyarak NGF olarak istihdam. PSiO2 potansiyelini NGF için bir iletim sistemi olarak hizmet etmek için yeterli NGF doz nöronal farklılaşma teşvik ve PC12 hücreleri ve DRG nöronlar akıbet teşvik için serbest bırakmak için yeteneklerini göstererek vitro gösterdi. Mühendislik filmleri NGF uzun vadeli rezervuar gelecekteki tedavi içinde vivoiçin kullanılabilir.
Fabrikasyon PSi filmlerin yapısal özellikler özellikle NGF yükü için özel olarak tasarlanmış; akım yoğunluğu elektrokimyasal gravür sürecinin yaklaşık 40 gözenek boyutu elde etmek için ayarlanmış NGF, bir protein 26.5 kDa32 molecular weight ve ~ 4 nm33, karakteristik çapı ile kolayca kapsayan nm gözenekli matris içinde. Ayrıca, gözenekli iskele termal oksidasyonunu NGF fiziksel adsorpsiyon etkinleştirmek için olumsuz ücret oksitlenmiş PSi yüzeye pozitif yüklü proteinin elektrostatik çekim tarafından gerçekleştirildi. Yüzey kimyası psi yükleme etkinliği üzerinde büyük bir etkisi giderek artan ve kolayca yükü ve gözenekli matris arasındaki etkileşimler daha iyi kontrol için ayarlanabilir. Bu etkileşimler daha sonra adsorbe protein molekül yapısını ve onların bioactivity34,35,36dikte. Sonuç olarak, sistem en uygun yükleme NGF dikkatli uygun gözenek boyutu, yüzey özellikleri ve solvent ve belirtilen parametreleri dikte oluşturduğu efekt protein yükleme yükleme ideal seçerek elde etmek için ayarlanmış etkinlik. Bu nedenle, yüzey kimyası (Örneğin, akım yoğunluğu, gravür zaman, türü ve dopant veya elektrolit konsantrasyonu), üretim parametrelerinde değişiklik veya çözüm kompozisyon yükleme yükleme etkinliği ve bioactivity in etkileyebilir zengin protein.
PSi orPSiO2ana bilgisayardan bir yükü yayın oranı genellikle iki eşzamanlı mekanizmaları, yükü moleküllerin geçici difüzyon ve Si iskele37bozulması kombinasyonu tarafından dikte edilir. Erozyon ve sonraki çözünme hızı hastalık durumu28,38,39ve implantasyon site, onun patoloji tarafından etkilenir. Önceki çalışmalarında farklı yayın oranı belirli bir tedavi uygulamasını için gerekliyse, yayın profil değiştirilebilir ve PSi yüzey38,40yüzey kimyası değiştirerek uzun süreli olduğunu kurulduğu, 41. Termal oksidasyon, termal kömürleşme ve hydrosilylation teknikleri, gibi çeşitli kimyasal değişiklikler PSi yüzey stabilize etmek ve onun bozulması ve bunun neticesi olan yükü yayın35,42 etkiler gösterilmiştir ,43,44,45. Kovalent bağlar koptu zaman yük yalnızca yayımlanır çünkü Ayrıca, daha uzun süreli bir sürümde NGF yüklenmesini protein molekülleri kovalent eki Si iskele yolu ile çeşitli yüzey kimyası rotalar için taşıyıcılarda içine sonuçlanmalıdır veya Matrix Si destekleyen21bozulmuş.
Ayrıca, kendi üretim sürecini takiben, PSi microparticles46, nano tanecikleri47 veya müstakil membranlar26da taşıyıcı olarak istihdam edilecek, gibi ince filmlerin yanı sıra çeşitli yapılandırmaları içine işlenebilir NGF ve tanışın belirli uygulama ihtiyaçları için.
Klinik olabilmek için PSiO2 taşıyıcıları NGF içeriğinde terapötik dozlarda aralığını ulaştırılması gerekmektedir. Yöntem iletişim kuralında tanımlanan, NGF yüklü PSiO2 Taşıyıcılar hücre medya 2 mL tutarlı bir hacim içine tanıtıldı veya PBS tamponu ve böylece, yükleme çözümü ve yüklenen ilgili NGF kütle konsantrasyonu verim için ayarlanmış bir Test vitro sistemi için geçerlidir NGF konsantrasyon yayımladı. Ex vivo veya vivo içinde ortamlar gibi farklı sistemler için bu yöntemi kullanan zaman çözüm yükleme NGF konsantrasyon artış ve göre gerekli doz ayarlanması gerekir. Alternatif olarak, daha yüksek NGF içeriği test edilmiş alan başına birden çok taşıma tanıtmak veya PSiO2 örneklerin geniş alanlar kullanarak elde edilebilir.
Ayrıca, bu yayın dönemi boyunca daha sonra zaman noktaları yayımlanan NGF konsantrasyonları çok önceki zaman puan daha düşük olması gerekmektedir. NGF akı zaman içinde sabit değil aslında uygulama ihtiyaçlarına göre sistemini tasarlarken dikkate alınması gerekir.
Sistemleri geliştirilmiştir ve bunların çoğu literatürde bildirilen polimer esaslı sistem olan çok sayıda NGF teslim, sentetik veya doğal polimer oluşan10,11,12,15 conjugates , 16 , 17. bu sistemleri etkili göstermiştir sürekli yayın profilleri, ancak, yayın döneminin önemli patlama etkisi ile birkaç gün süre içinde yayılmış. Kritik sınırlamaları bioactivity farklı teskin ajanlar18,48, yanı sıra gelişmiş ve karmaşık kullanımını gerektiren kapsülleme işlemi üzerine kaybı gibi bazı bu teslim platformlar muzdarip imalat teknikleri16. Proteinler için dağıtım sistemlerinin tasarımında en büyük zorluklardan biri üzerine taşıyıcı sistemi içinde tuzak moleküllerin bioactivity korumak için yeteneğidir. Proteinler veya peptidler bu hassas biomolecules yüklerken iki önemli faktör vardır güçlü organik çözücüler kullanmadan PSi/PSiO2 RT veya daha düşük sıcaklıklarda dahi içine yüklenebilir. Önceki çalışmalarda PSi/PSiO2 yüzey kimyası yüklü proteinler35,36olası denatürasyon en aza indirmek önemli bir rol oynar gösterdi. Bu nedenle, PSi/PSiO2 özellikle dağıtım sistemleri için büyüme faktörleri genel olarak geliştirmek ve NGF avantajlı bir nanomaterial.
Mevcut iş NGF doğrudan yönetimi içine MSS nörodejeneratif hastalıkların potansiyel tedavisi için yeni bir tedavi yaklaşımı olarak bu yöntemi kullanan üzerinde odaklanmıştır. PSiO NGF yüklü2 taşıyıcıları farelerin beyinlerinde implante ve platform olarak uzun vadeli implantlar etkinliğini okudu vivo içindeolduğunu. Ayrıca, bu gelecek vadeden gemileri non-invaziv biolistics49ile birleştirerek,50 bir yüksek uzaysal çözünürlük NGF yüklü PSiO2 parçacıkları bir roman Pnömatik kullanarak yerelleştirilmiş bir alana yönetmek izin verebilir zamanmekansal ilaç idaresi gerekli olduğu nörodejeneratif hastalıklar, tedavi için kılcal tabancası. Ayrıca, NGF nöronal büyüme bir kimyasal degrade şekilde51, akson rehberlik moleküllerine benzer yönlendirebilirsiniz. Bu nedenle, yüklü PSiO2 taşıyıcıları cezbedici sıcak noktalar için NGF büyüme, diğer yönetmenlik cues52,53için tamamlayıcı yönlendirmek için görevi görebilir. Buna ek olarak, PSiO2taşıyıcılar özellikle NGF teslimini birkaç ay kadar bir zaman fazla genişletilmiş süre için PSiO2 nanostructure ve onun yüzey kimyası daha fazla ayarlama tarafından ayakta tutmak için uygun olabilir.
The authors have nothing to disclose.
MS ve ES Çekirdek Hizmetleri kabul ve yaşam bilimleri ve mühendislik ve Russell Berrie nanoteknoloji Enstitüsü Technion’mali desteği için kamyon ı. Lokey Merkezi’nden destekler.
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |