Aquí, presentamos un protocolo para el diseño y fabricación de películas de silicio poroso (PSi) nanoestructurados como portadores degradables para el factor de crecimiento nervioso (NGF). La diferenciación neuronal y en consecuencia de PC12 células y ratones raíz dorsal (GRD) del ganglio las neuronas se caracterizan sobre el tratamiento con los portadores cargados de NGF PSi.
A pesar del gran potencial del NGF para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, su administración terapéutica representa un reto importante ya que la proteína no cruza la barrera blood – brain, debido a sus propiedades químicas y por lo tanto requiere a largo plazo entrega al cerebro para ejercer un efecto biológico. Este trabajo describe la fabricación de las películas nanoestructurados PSi como degradables portadores de NGF para la entrega sostenida de esta proteína sensible. Los portadores de la PSi están específicamente diseñados para obtener eficacia de carga alta y continua liberación de NGF por un período de cuatro semanas, manteniendo su actividad biológica. El comportamiento de los portadores de NGF-PSi como un sistema de entrega de NGF es investigado en vitro examinando su capacidad de inducir la diferenciación neuronal y en consecuencia de células PC12 y disociada de las neuronas DRG. Se evalúa la viabilidad de las células en presencia de portadores de PSi limpio y cargado de NGF. La bioactividad de NGF liberado de los portadores de la PSi es comparada con el tratamiento convencional de repetidas administraciones de NGF gratis. Diferenciación de las células PC12 es analizada y caracterizada por la medición de tres diferentes parámetros morfológicos de las células diferenciadas; (i) el número de neuritas extracción de la soma de longitud (ii) el total neurites y (iii) el número de puntos de ramificación. Las células PC12 tratadas con los portadores de NGF-ISP demuestran una diferenciación profunda durante todo el período de lanzamiento. Además, células neuronales DRG con los portadores de NGF-PSi muestran una iniciación neurite extensa, similar a las neuronas tratadas con administraciones repetidas de NGF gratis. Los portadores tunable estudiados demuestran los implantes a largo plazo para la liberación de NGF con un potencial terapéutico para enfermedades neurodegenerativas.
NGF es esencial para el desarrollo y mantenimiento de las neuronas en el sistema nervioso periférico (PNS)1 y desempeña un papel crucial en la supervivencia y la función de las neuronas colinérgicas del prosencéfalo basal en el sistema nervioso central (SNC)2. Su alto potencial farmacológico para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas central como la enfermedad de Alzheimer y de Parkinson, ha sido ampliamente demostrada, con ensayos clínicos actualmente en progreso3,4,5, 6. El mayor desafío en la entrega de NGF al SNC reside en su incapacidad para atravesar la barrera hematoencefálica (BBB), cuando se administra sistémicamente7. Más aún, NGF susceptibilidad a rápida degradación enzimática hace que su vida media corta y limita significativamente su uso terapéutico8,9. Por lo tanto, es un desafío para diseñar sistemas que permiten una liberación prolongada y controlada de NGF en forma segura. Diversos sistemas de entrega de NGF, incluyendo sistemas basados en polímeros, han sido estudiados10,11,12,13,14,15, 16 , 17. los perfiles de liberación de estos sistemas se caracterizan a menudo por un distinto estallido inicial, seguido de una liberación lenta y continua, donde en la última etapa la tasa de liberación fue significativamente baja en comparación con la explosión inicial11 ,18,19. Además, la inactivación de la proteína por los productos ácidos de la degradación de los polímeros (por ejemplo, ácido poly(lactic-co-glycolic)) o la pérdida de bioactividad del NGF durante el proceso de encapsulación fueron observadas con este sistemas20.
Nanoestructurados PSi se caracteriza por varias propiedades atractivas, incluyendo su superficie, gran volumen poroso, biocompatibilidad y degradabilidad sintonizable en fluidos corporales, predestinó para un prometedor fármaco entrega plataforma de21, 22,23,24,25,26,27,28. La selección apropiada de las condiciones de anodizado permite ajustar fácilmente las propiedades estructurales del PSi (tamañop. ej., la porosidad y poro) para adaptar la carga de droga y liberación cinética21,27. Por otra parte, diversas rutas químicas convenientes permiten modificar la superficie de la PSi y por ajustar aún más la velocidad de disolución del andamio Si bajo condiciones fisiológicas y las tasas de liberación de la droga22,24, 29,30.
Este trabajo se centra en el diseño de un sistema de entrega PSi para liberación controlada prolongada de NGF. El efecto de los portadores de NGF-PSi en la diferenciación neuronal y en consecuencia se examina usando las células PC12 y disociado las neuronas DRG. Demostramos que el NGF cargado ha conservado su bioactividad induciendo la consecuencia del neurite y profunda diferenciación a lo largo de un período de 1 mes lanzamiento dentro de una sola administración.
Películas degradables nanoestructurados PSiO2 son fabricadas y empleadas como portadores de NGF, permitiendo su liberación constante y prolongada, manteniendo su actividad biológica. El potencial del PSiO2 servir como un sistema de entrega para NGF es demostrado en vitro demostrando su capacidad para liberar la suficiente dosis de NGF para inducir la diferenciación neuronal y promover la extensión de células PC12 y las neuronas DRG. Las películas de ingeniería pueden utilizarse como reservorios a largo plazo de NGF para futuros tratamientos en vivo.
Las propiedades estructurales de las películas fabricadas de PSi fueron específicamente diseñadas para carga de NGF; la densidad de corriente del proceso de la aguafuerte electroquímica fue ajustada para obtener el tamaño de los poros de aproximadamente 40 nm que sería fácilmente acomodar el NGF, una proteína con un molecular weight de 26.5 kDa32 y un diámetro característico de ~ 4 nm33, dentro de la matriz porosa. Por otra parte, oxidación térmica del andamio poroso fue realizada para permitir la adsorción física de NGF por atracción electrostática de la proteína cargada positivamente a la superficie oxidada cargada negativamente de la PSi. La química superficial de PSi ejerce un efecto importante sobre la eficacia de la carga y puede ajustarse fácilmente con el fin de mejorar el control de las interacciones entre la carga y la matriz porosa. Posteriormente, estas interacciones determinan la estructura de las moléculas de proteína adsorbida y su bioactividad34,35,36. En conclusión, el sistema se ajustó para obtener una óptima carga de NGF seleccionando cuidadosamente el tamaño de poro adecuado, las características de superficie y el ideal carga del solvente y el efecto resultante de los dictados de los parámetros mencionados la carga de la proteína eficacia. Por lo tanto, cualquier cambio en los parámetros de fabricación (por ejemplo, densidad de corriente, tiempo de grabado, tipo y concentración de dopante o electrolitos), química de superficies o cargar la composición de la solución puede afectar la eficacia de la carga y la bioactividad de la cargados proteínas.
La tasa de liberación de una carga desde el host de2PSi orPSiO es dictada generalmente por una combinación de dos mecanismos simultáneos, hacia fuera-difusión de las moléculas de la carga útil y la degradación del andamio Si37. La erosión y la velocidad de disolución subsecuente son afectados por el sitio de implantación, su patología y enfermedad estado28,38,39. Fue establecido en trabajos anteriores que si una tasa de liberación diferentes es necesaria para una determinada aplicación terapéutica, el perfil de liberación puede ser modificado y prolongado, cambiando la química superficial de los PSi superficie38,40, 41. Han demostrado modificaciones químicas diversas, tales como la oxidación térmica, térmica carbonización y hydrosilylation técnicas, para estabilizar la superficie de PSi y afectan a su degradación y consecuente carga lanzamiento35,42 ,43,44,45. Por otra parte, carga de NGF en los portadores por el accesorio covalente de las moléculas de proteína al andamio Si a través de varias rutas de superficie química dará lugar a una liberación más prolongada debido a la carga sólo se libera cuando se rompen los enlaces covalentes o los apoyo Si matriz es degradado21.
Además, a raíz de su proceso de fabricación, PSi se puede procesar en varias configuraciones además de películas delgadas, tales como micropartículas46, nanopartículas47 o membranas independientes26, que también se puede emplear como portadores de para NGF y satisfacer necesidades específicas.
Para ser clínicamente relevantes, el contenido de NGF en el PSiO2 portadores debe alcanzar el rango de dosis terapéuticas. En el método descrito en el protocolo, los portadores de2 PSiO cargado de NGF se introducen en un volumen constante de 2 mL de medio de celular o tampón PBS y por lo tanto, la concentración de la solución de carga y la masa correspondiente de NGF cargada se ajustaron para rendir un libertad concentración de NGF que es relevante para el sistema probado en vitro . Al utilizar este método para diversos sistemas, tales como ambientes ex vivo o en vivo , la concentración de NGF carga solución debe ser aumentada y ajustada según la dosis necesaria. Por otra parte, mayor contenido de NGF puede obtenerse mediante la introducción de múltiples portadoras por área probado o mediante el uso de áreas más grandes de PSiO2 muestras.
Por otra parte, cabe señalar que en momentos posteriores a lo largo del período de lanzamiento, las concentraciones de NGF liberadas son mucho menores que en anteriores momentos. El hecho de que el flujo de NGF no es constante en el tiempo debe tomarse en cuenta al diseñar el sistema según las necesidades de aplicación.
Entrega de NGF numerosos sistemas han sido desarrollados y divulgados en la literatura, la mayoría de ellos son sistemas basados en polímero, compuesto de polímeros sintéticos o naturales conjugados10,11,12,15 , 16 , 17. estos sistemas han demostrado eficaces perfiles de liberación sostenida, sin embargo, el período de lanzamiento abarcó durante un período de varios días con un efecto de explosión significativa. Algunas de estas plataformas de distribución sufren de limitaciones críticas tales como la pérdida de bioactividad en el proceso de encapsulación, que requieren el uso de diferentes estabilizadores agentes18,48, así como de sofisticados y complejos técnicas de fabricación16. Uno de los mayores retos en el diseño de sistemas de administración de las proteínas es la capacidad para mantener la actividad biológica de las moléculas al quedar atrapado en el sistema. Proteínas o péptidos se pueden cargar en PSi/PSiO2 a temperatura ambiente o incluso a temperaturas más bajas sin necesidad de utilizar solventes orgánicos fuertes, que son dos factores importantes al cargar estas biomoléculas sensibles. Estudios anteriores han demostrado que PSi/PSiO2 química superficial juega un papel crucial en la reducción al mínimo posible desnaturalización de las proteínas cargados35,36. Por lo tanto, PSi/PSiO2 es un nanomaterial ventajosa para el desarrollo de sistemas de entrega para factores de crecimiento en general y NGF en particular.
El trabajo actual se centra en utilizar este método como un nuevo enfoque terapéutico para la administración directa del NGF en el SNC para el tratamiento potencial de enfermedades neurodegenerativas. Los portadores de2 PSiO cargado de NGF pueden ser implantados en el cerebro de ratones y la eficacia de la plataforma de los implantes a largo plazo es estudiada en vivo. Además, con este prometedor portadores biolística invasiva49,50 puede permiten administrar las cargado de NGF PSiO2 partículas en una resolución muy espacial a un área localizada mediante una novela neumática pistola capilar para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, donde se requiere una administración de la droga espaciotemporal. Más aún, NGF puede dirigir crecimiento neuronal en una manera gradiente química51, similares a las moléculas de la dirección del axon. Así, los portadores cargados de2 PSiO pueden servir como focos de atrayente a NGF, para dirigir el crecimiento, complementaria a otras señales dirección52,53. Además, los portadores de PSiO2pueden ser adaptados específicamente para mantener la entrega de NGF por un período de tiempo tan extendido de hasta varios meses más templando el PSiO2 nanoestructura y su química superficial.
The authors have nothing to disclose.
MS y ES reconocer los principales servicios y apoyo Lorry I. Lokey del centro de la ingeniería, Ciencias de la vida y el apoyo financiero del Instituto de nanotecnología Russell Berrie en el Technion.
Acetone | Gadot | 830101375 | |
Amphotericin | Biological Industries | 03-028-1B | |
Aqueous HF (48%) | Merck | 101513 | |
AZ4533 photoresist | Metal Chem, Inc. | AZ4533 | |
BSA fraction v | MP biomedicals | 0216006950 | |
BSA solution (10%) | Biological Industries | 03-010-1B | |
Collagen type l | Corning Inc. | 354236 | |
Collagenase | Enco | LS004176 | |
Collagen-coated plastic coverslips | NUNC Thermanox | 1059846 | |
D-(+)-glucose | Sigma-Aldrich Chemicals | G8170 | |
Dispase-II | Sigma-Aldrich Chemicals | 4942078001 | |
Donkey anti mouse IgG H&L conjugated Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150073 | |
Ethanol absolute (99.9%) | Merck | 818760 | |
FBS | Biological Industries | 04-121-1A | |
Formaldehyde/glutaraldehyde (2.5%) in 0.1 M sodium cacodylate | Electron Microscopy Sciences | 15949 | |
Freon | Sigma-Aldrich Chemicals | 613894 | |
Guanidine-HCl | Sigma-Aldrich Chemicals | G7294 | |
Ham's F-12 nutrient mixture | Thermo Scientific | 11765054 | |
HBSS | Thermo Scientific | 14185-045 | |
HEPES (1M) | Thermo Scientific | 15630-056 | |
HS | Biological Industries | 04-124-1A | |
Human β-NGF ELISA Development Kit | Peprotech | 900-K60 | |
Immumount solution | Thermo Scientific | 9990402 | |
L-15 medium | Sigma-Aldrich Chemicals | L5520 | |
Laminin | Thermo Scientific | 23017015 | |
L-glutamine | Biological Industries | 03-020-1A | |
Mouse anti neurofilament H (NF-H) (phosphorylated antibody) antibody | BiolLegend | SMI31P | |
Murine β-NGF | Peprotech | 450-34-20 | |
Normal donkey serum (NDS) | Sigma-Aldrich Chemicals | G9023 | |
Papain | Sigma-Aldrich Chemicals | p-4762 | |
Paraformaldehyde 16% solution | Electron Microscopy Sciences | BN15710 | |
PBS (pH 7.4) | prepared by dissolving 10 mM Na2HPO4, 1.8 mM KH2PO4, 137 mM NaCl and 2.7 mM KCl in double-distilled water (ddH2O, 18 MΩ). |
||
PBS X10 | Biological Industries | 02-020-1A | |
PC12 cell line | ATCC | CRL-1721 | |
Penicillin–streptomycin | Biological Industries | 03-032-1B | |
Percoll | Sigma-Aldrich Chemicals | p1644 | |
Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich Chemicals | P4832 | |
PrestoBlue reagent | Thermo Scientific | A13261 | |
RPMI medium | Biological Industries | 01-100-1A | |
Si wafer | Siltronix Corp. | Highly-B-doped, p-type, 0.00095 Ω-cm resistivity, <100> oriented | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich Chemicals | S2002 | |
Sodium hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich Chemicals | S8045 | |
Tannic acid | Sigma-Aldrich Chemicals | 403040 | |
Triton X-100 | Chem-Impex International Inc. | 1279 |