الخلايا الاساسيه الثقافة المنقية جابايرجيك أو الخلايا العصبية جلوتاميجيك أنشئت من خلال الفرز الخلية المنشطة الفلورية
概要
يصف هذا البروتوكول طريقه فرز الخلايا القائمة علي تنقيه وثقافة الخلايا العصبية الفلورية جابايرجيك أو جلوتاميرجيك من نيوكورتكس والحصين من الفئران بعد الولادة أو الفئران.
Abstract
الهدف العام لهذا البروتوكول هو توليد الثقافات العصبية المنقية المستمدة من الخلايا العصبية جابايرجيك أو جلوتاموجيك. يمكن ان تكون مثقف الخلايا العصبية المنقية في وسائل الاعلام المحددة لمده 16 يوما في المختبر وقابله لأي تحليلات تجري عاده علي الثقافات المنفصلة ، بما في ذلك التحاليل الفسيولوجية والمورفولوجية والبقاء علي قيد الحياة. والميزة الرئيسية لهذه الثقافات هي ان أنواعا معينه من الخلايا يمكن دراستها بشكل انتقائي في غياب التاثيرات الخارجية المعقدة ، مثل تلك الناشئة عن الخلايا الدبقيه أو أنواع عصبيه أخرى. عند التخطيط للتجارب مع الخلايا المنقية ، ومع ذلك ، من المهم ان نلاحظ ان الخلايا العصبية تعتمد بقوة علي وسائل الاعلام المكيفة لنموها والبقاء علي قيد الحياة. الاضافه إلى ذلك ، تعتمد الخلايا العصبية الجلوتاماليه علي العوامل التي تفرزها الخلايا غير المشبعة لإنشاء ناقل الحركة المتشابك. ولذلك ، فاننا نقوم أيضا بوصف طريقه لمشاركه الخلايا العصبية والكريات الداليه في ترتيب عدم الاتصال. باستخدام هذه الطرق ، وقد حددنا الاختلافات الرئيسية بين تطوير الشبكات العصبية جابايرجيك والخلايا الجلوتاموجيك. التالي ، دراسة ثقافات الخلايا العصبية المنقية لديها إمكانات كبيره لتعزيز فهمنا لكيفيه تطور الجهاز العصبي ووظائفه. وعلاوة علي ذلك ، قد تكون الثقافات المنقية مفيده للتحقيق في العمل المباشر للعوامل الدوائية ، وعوامل النمو أو لاستكشاف عواقب التلاعب الجيني علي أنواع معينه من الخلايا. بما ان المزيد والمزيد من الكائنات المحورة وراثيا تصبح متاحه ، ووصف أنواع اضافيه من الخلايا المحددة من الفائدة ، ونحن نتوقع ان البروتوكولات الموصوفة هنا سوف تنمو في تطبيقها وإمكاناتها.
Introduction
فرز الخلايا هو أداه قويه لعزل الخلايا الحية من الفائدة من خليط غير متجانس من الخلايا. يمكن فرز الخلايا استنادا إلى معايير الحجم والشكل ، فضلا عن التعبير عن علامات الفلورسنت1،2. في كثير من الأحيان ، تستخدم الأجسام المضادة المترافقة بالفلور لتسميه أنواع الخلايا المتميزة عن طريق استهداف مستضدات السطح الخاصة بالخلايا3،4. وبدلا من ذلك ، تم تصميم الكائنات المحورة وراثيا أو منظومات الإيصال الفيروسية للتعبير عن الفلوبوريس ببموجب المروجين الخاصين بالخلايا5،6. تاريخيا ، كان تطوير الاداات المحورة وراثيا والحيوانية مكلفه ومضيعه للوقت. وفي الاونه الاخيره ، ادي تناقص التكاليف وقله الصعوبات التقنية إلى زيادة هائله في عدد خطوط المراسلين المتاحة. وبما ان توافر الاداات المحورة وراثيا والحيوانية المراسلة لا يزال ينمو ، فانه ينبغي أيضا فائده وامكانيه تطبيق أساليب فرز الخلايا القائمة علي الفلورية.
وقد أثبتنا مؤخرا ان فرز الخلايا من الكائنات المحورة وراثيا يمكن تطبيقه بشكل روتيني لتنقيه الخلايا العصبية الاوليه استعدادا لثقافة الخلية7. عن طريق فرز الخلايا من الفئران أو الفئران, كنا قادرين علي عزل والثقافة الخلايا العصبية الفلورسنت, التي تعبر عن البروتينات الفلورية مراسل علي وجه التحديد في اما جابايرجيك أو الخلايا العصبية جلوتامريجيك6,8,9. من خلال دراسة هذه الثقافات العصبية المنقية, كنا قادرين علي تحديد فرق مهم في الطريقة جابايرجيك والخلايا العصبية جلوتاموجيك تعتمد علي العوامل التي تفرزها الخلايا التي يفرزها لإنشاء الإرسال متشابك7. بالاضافه إلى ذلك ، من خلال المشاركة في الخلايا الددميه مع العصبية المنقية ، تمكنا من تمديد الملاحظات السابقة التي تثبت الدور الحاسم الذي تلعبه الخلايا الددميه في نمو وبقاء العصبونات10،11. وهكذا ، من خلال مزيج من خليه الفرز وثقافة الخلية ، تمكنا من دراسة ليس فقط تطوير أنواع معينه من الخلايا العصبية في عزله ، ولكن كانت قادره علي التحقيق في تاثير الكريات الدبقيه علي وظيفتها.
نحن نقدم هنا بروتوكولا لتنقيه وثقافة الخلايا العصبية جابايرجيك و جلوتاميرجيك من القشرة والحصين من الفئران المحورة وراثيا أو الفئران. ونحن نقدم أيضا طريقه لعدم الاتصال الثقافة المشتركة للخلايا العصبية المنقية والخلايا الدليج ، وتكييفها من جيسسلر وآخرون12. من أجل توليد الثقافات جابايرجيك المنقية ، قمنا بفرز الخلايا العصبية الفلورية من VGAT-فينوس-والفئران Wistar8 أو vgat-فينوس الفئران13، والتي تعبر بشكل انتقائي عن تعزيز البديل البروتين الفلوري الأصفر (فينوس) في > 95 ٪ من الخلايا العصبية جابايرجيك القشرية. لتوليد الثقافات جلوتاميرجيك المنقية ، قمنا بفرز الخلايا العصبية الفلورية من NexCre. Ai9 الفئران6،9، والتي تعبر عن tdtomato في الخلايا العصبية القشرية جلوتاميرجيك. يمكن اجراء الفرز والثقافة بأكملها في غضون 3-4 h ويمكن استخدامها لتوليد مئات من الثقافات تكرار مناسبه للتحليل الكهربي ، المورفولوجية وبقاء الخلية. طريقه بسيطه وقابله للتكرار ويمكن ان تنتج الثقافات العصبية المنقية التي هي أكبر من 97 ٪ نقيه لنوع الخلية من الفائدة.
Protocol
Representative Results
Discussion
ونحن هنا وصف الطريقة التي تجمع بين فرز وذبح الخلايا العصبية الاساسيه لتوليد الخلايا العصبية النقية الثقافات. هذا الأسلوب يستغرق حوالي 1 ساعة أطول من بروتوكول ثقافة الخلايا العصبية منفصلة الاساسيه النموذجية حتى الآن يسمح لتوليد مئات من الثقافات النسخ المتماثل التي تحتوي علي أنواع معينه من الخلايا العصبية. الخلايا العصبية المنقية ، والتي يمكن زراعتها في عزله لمده 16 يوما علي الأقل ، وتوسيع محاور و تشعبات ويمكن إطلاق القطارات المتكررة من إمكانات العمل (الشكل 2 والشكل 3). والاهم من ذلك ، ان هذه الخلايا قابله لنفس التحاليل التجريبية مثل الثقافات العصبية الاساسيه المنفصلة ، بما في ذلك التحاليل الكهربية والمورفولوجية والبقاء. ومن الفوائد الرئيسية للعمل مع هذه الثقافات المنقية ان تطوير أنواع معينه من الخلايا يمكن دراسته في عزله. لدعم تطوير الثقافات المنقية ، ونحن نقدم أيضا بروتوكول لمشاركه الخلايا العصبية المنقية مع الخلية المنزلقة. كما هو مبين سابقا ، المشتركة في الخلايا العصبية المنقية مع الكريات الطائرات الشراعية يحسن البقاء علي قيد الحياة ، والنمو ، ويمكن تعزيز تكوين شبكه7 (الشكل 4). التالي ، فاننا نقدم هنا مجموعه من الأساليب التي ينبغي ان تعزز دراسة تفاعلات الخلايا العصبية غير الخلوية ، وقد تكون مفيده لدراسة التنمية والتفاعل بين أنواع الخلية الأخرى من الفائدة.
وقد كشفت الدراسات حول ثقافات الخلايا العصبية جلوتاميرجيك المنقي الرؤى الاساسيه في الطريقة التي تفرزها خليه الدال العوامل التي تعزز تطوير الشبكات العصبية وتكوين المشبك16,17,18 . بشكل عام, وقد تم تطبيق أساليب لتنقيه أنواع الخلايا العصبية محدده بنجاح أكبر لدراسة تطور الخلايا العصبية جلوتاموجيك بدلا من الخلايا العصبية جابايرجيك. وقد ادي ذلك إلى تفاوت في فهمنا لكيفيه تطور هذين النوعين من الخلايا. النظر إلى ان جابايرجيك والخلايا العصبية جلوتاموجيك تختلف بشكل كبير من حيث التشريح, علم وظائف الجسم وأصول النمو, فمن المهم ان ندرس الخلايا العصبية جابايرجيك في حقهم الخاص, لفهم أفضل وظائفهم ووظائفهم. باستخدام البروتوكول المعروض هنا ، وقد حددنا سابقا الاختلافات الهامه في الطريقة جابايرجيك والخلايا العصبية جلوتاموجيك تعتمد علي العوامل التي تفرزها الخلايا التي يفرزها لإنشاء الإرسال متشابك7. من خلال نشر هذا البروتوكول نامل ان الآخرين يمكن ان تجعل المزيد من الرؤى في التفاعلات الهامه بين الخلايا العصبية والكريات الدبقيه.
في هذا البروتوكول ، ونحن وصف تدفق الخلوي علي أساس طريقه فرز الخلايا ، والتي استخدمناها لتنقيه جابايرجيك أو الخلايا العصبية جلوتاموجيك من خطوط القوارض المحورة وراثيا مختلفه. تم فرز الخلايا العصبية الزهرة الايجابيه جابايرجيك من VGAT فينوس الفئران13 أو الفئران8 و tdtomato ايجابيه جلوتاماماتيك الخلايا العصبية تم فرزها من nexcre. Ai9 الفئران (ولدت أصلا من NexCre9 و Ai9 مراسل الخطوط6، انظر توركو وآخرون ، 20187). في السنوات الاخيره ، وبسبب التطورات التكنولوجية ، أصبح جيل الكائنات المحورة وراثيا أسهل بكثير. وعلي هذا النحو ، فان توافر الكائنات التي تعبر عن جزيئات الفلورسنت ، في العديد من أنواع الخلايا المختلفة ، قد نما بسرعة. وقد ادي هذا ، بدوره ، إلى زيادة استخدام وتطبيق فرز الخلايا المنشطة الفلورية. في حين توجد الطرق البديلة لعزل خلايا الفائدة حاليا16،19،20، فانها تعرقل إلى حد ما باعتمادها علي توافر الأجسام المضادة المناسبة للسطح الذي يحدث بشكل طبيعي مستضدات. وهذا يحد من تنوعها بالمقارنة مع طرق فرز الخلايا المستندة إلى الفلورية ، والتي يمكن استخدامها بالفعل لفرز الخلايا من العديد من الخلايا الخاصة بالمراسلات المعدلة وراثيا والمتوفرة بالفعل. ومع ذلك ، عندما الأمثل ، وطرق الفرز المستندة إلى الأجسام المضادة يمكن ان تكون سريعة وعاليه الغلة ، وربما أفضل الحفاظ علي تشريح الخلية ، من خلال السماح تنقيه الخلايا مع محاور والتشعبات سليمه21. ولذلك ينبغي النظر في أساليب فرز الأجسام المضادة عند اتخاذ قرار بشان استراتيجية الفرز. وفي نهاية المطاف ، فان نوع الخلية من الفائدة ، والعمر الذي يتم فيه فرز الخلايا ، وتوافر الكائنات المحورة وراثيا أو المستضدات السطحية وعدد الخلايا اللازمة سيكون العوامل الحاسمة عند اختيار استراتيجية الفرز الأنسب.
علي الرغم من ان الفرز الخلوي القائم علي الفلورية هو طريقه بسيطه وقابله للتكرار لتنقيه الخلايا ، ينبغي توخي الحذر اثناء خطوات معينه من البروتوكول للحفاظ علي جوده الخلية. علي سبيل المثال ، بعد كل خطوه طرده ، من المهم التاكد من أعاده تعليق الخلية بيليه بأسرع وقت ممكن وان الخلايا قد تم استردادها بنجاح. في بعض الأحيان ، يمكن ان يزعج بيليه الخلية عند أزاله supernatant. ولذلك ينصح ، بين الخطوات الطردة ، للتحقق من وجود خلايا تحت المجهر لاستبعاد اي فقدان الخلايا واسعه النطاق. بعد طلاء الخلايا ، يجب السماح للخلايا بالتصاق ب 1 ساعة علي الأقل قبل الرضاعة. إذا تم تغذيه الخلايا في وقت مبكر جدا ، قد تصبح بعض الخلايا طردت من الشفة ، التالي الحد من كثافة الثقافة. بعد 1 ح في الثقافة ، فمن الحكمة لتقييم صحة الخلية. إذا كانت الخلايا لا تظهر بصحة جيده (يظهر مثال للخلايا السليمة في الشكل 2 ا) ، أو ان هناك موتا كبيرا للخلايا ، فقد يكون هذا مؤشرا علي وجود مشكله اثناء اجراء التفكك أو الفرز. وهناك اعتبار آخر مهم ، عند زراعه اي نوع من الخلايا ، هو ان تاخذ الرعاية عند أداره وسائل الاعلام الثقافة الخلية. الدوري الأميركي للمحترفين وسائل الاعلام يحتوي علي الفينول الأحمر ، الذي يعمل كمؤشر الأس الهيدروجيني22. إذا أصبحت الوسائط صفراء جدا في اللون ، فهذا يشير إلى ان درجه الحموضة حمضيه جدا. إذا أصبحت الوسائط ورديه جدا ، فهذا يشير إلى ان الحل قلوي جدا. حلول الأسهم مفتوحة لفترات طويلة ، وخاصه وسائل الاعلام المنقولة إلى أنابيب مخروطيه ، تميل إلى ان تصبح أكثر قلوية مع مرور الوقت. ولذلك فمن المستحسن ان تشكل وسائل الاعلام الجديدة كامله الدوري الأميركي للمحترفين كل أسبوع ووسائل الاعلام كامله كل أسبوعين (المخازن المؤقتة المتوسطة في ظروف الغلاف الجوي ، وينبغي بالتالي ان تكون أكثر استقرارا). أخذ هذه النقاط في الاعتبار انه ينبغي ان يكون من الممكن إنشاء الخلايا المنقية الثقافات في اي مختبر مع الوصول إلى فرز الخلايا ومعدات ثقافة الخلية.
في معظم تجاربنا أنتجنا الثقافات النقية من الحيوانية واحده. ومع ذلك ، عند تنقيه الخلايا للتحليلات البيوكيميائية ، قد يكون من الضروري تجميع العديد من الكائنات معا للفرز. لقد نجحنا في فرز ما يصل إلى 8 فئران جنينيه (اليوم الجنيني 13 الحيوانية) باستخدام البروتوكول المذكور أعلاه (البيانات غير معروضه). ومع ذلك ، إذا كان من المقرر فرز المزيد من الماشية ، فقد يكون من الضروري زيادة حجم كل من الحلول الورقية والصربية (الموصوفة في الخطوات 2-1-1-2-1-4) لاستيعاب الزيادة في كميه الانسجه. بالاضافه إلى ذلك ، إذا تم طلاء المزيد من الخلايا في الثقافة ، ثم قد يكون هناك حاجه إلى جدول التغذية أكثر تواترا. كنقطه انطلاق ، يمكن تغذيه الخلايا كل 7 أيام عن طريق أزاله 100 μL من وسائل الاعلام المكيفة وأضافه 200 μL من وسائل الاعلام الجديدة كامله الدوري الأميركي للمحترفين. من أجل بقاء الخلايا العصبية ، وإذا فرز المزيد من الماشية ، وينبغي إعطاء الفكر للتقليل من وقت الفرز قدر الإمكان. وهذا يتطلب في كثير من الأحيان الأمثل الدقيق للتحليلات المصب للاستخدام الفعال للخلايا المنقية. لقد قمنا بفرز بشكل روتيني الخلايا العصبية الماوس بمعدلات 600 الاحداث/s ، ما يصل إلى 500000-800000 خليه لكل الحيوانية (يوم بعد الولادة 0-2). ومع ذلك ، كان هذا دون الأمثل شامله لسرعه الفرز والظروف. ولذلك ، ينبغي ان يكون من الممكن إدخال مزيد من التحسينات علي سرعه الفرز والغلة.
تتطلب الخلايا العصبية المنقية وسائل الاعلام المكيفة لبقاءها. وقد ثبت هذا من قبل من قبل الخلايا العصبية والكريات الطائرات الشراعية بشكل منفصل ، وقبل علاج العصبونات مع وسائل الاعلام المكيفة المنزلقة10. في تجاربنا ، اخترنا لدعم الخلايا العصبية المنقية عن طريق القيام بالزراعات الخلوية السطحية علي ادراج الخلية شبه نفاذيه ، والتي يتم وضعها داخل لوحه ثقافة الخلية. وقد تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح لدراسة البروتينات المشتقة من الخلايا غير الخلوية وتفاعلها مع الخلايا العصبية12. عدم الاتصال ، ولكن الدعم المستمر المقدمة من هذا الأسلوب لديه عدد من المزايا بالمقارنة مع ثقافة منفصلة من الخلايا. وعلي الأخص ، فان الثقافة المشتركة للخلايا الددميه مع الخلايا العصبية تسمح للتنظيم المستمر وتكييف وسائل الاعلام الثقافة الخلية ، والتي تشبه بشكل وثيق في حاله الجسم الحي. الاضافه إلى ذلك ، فان الثقافة المشتركة المستمرة للخلايا تسمح بإشارات التغذية المرتدة المحتملة بين الخلايا العصبية والبقية ، وهو أمر غير ممكن في الثقافات المنفصلة. في البروتوكول الخاص بنا ، إذا لزم الأمر ، يمكن بسهوله حذف طريقه الثقافة المشتركة المستمرة ويمكن اجراء العلاج الكلاسيكي من الخلايا العصبية مع وسائل الاعلام المكيفة.
وباختصار ، يهدف البروتوكول المعروض هنا إلى تزويد القارئ بأساس متين يمكنه من خلاله تاسيس تجاربه الخاصة الخاصة بثقافة الخلايا المنقية. ونتوقع ان يستمر توافر الكائنات المحورة وراثيا والتركيبات الفيروسية في الزيادة في المستقبل المنظور. ولذلك ، فان تقنيات فرز الخلايا استنادا إلى الفلورية من المرجح ان تصبح أكثر استخداما وقيمه.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود أصحاب البلاغ ان يشكروا الدعم التقني الممتاز الذي قدمته جيني كيرش وانا تييشمولر في المرفق الأساسي لقياس التدفق الخلوي ، وهو المركز ألماني ريكوما-فورشونغزنتروم ، برلين. ونود ان نشكر جي سونغ علي مساعدته في تحليل البقاء علي قيد الحياة. ونود أيضا ان نشكر ريتا لورييرو علي مساعدتها في التقاط صور الفئران الفلورية وكريستيان ابنر للقراءة الناقدة للبروتوكول. وقد ولدت الفئران VGAT-فينوس المحورة وراثيا من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الفسيولوجية ، اوكازاكي ، m. هيباياشي و y. كاواجوتشي في معهد العلوم الفيزيولوجية ، Okazaki ، اليابان ، وذلك باستخدام pCS2 الزهرة التي قدمها الدكتور ا. مياواكي. ساندت هذا عمل كان بالمانيه بحث مجلس ([ديوتسكه] [فورسكهنغجيميندسكهفت], [دغ] [اكسك] 257 إلى [ايف]).
Materials
| Neural Basal A media (NBA) | ThermoFisher Scientific | 10888022 | Cell Culture Buffer |
| B27 | ThermoFisher Scientific | 17504001 | Culture supplement |
| Glutamax | ThermoFisher Scientific | 35050-038 | Culture supplement |
| Penicillin Streptomycin (10,000 U/mL) | ThermoFisher Scientific | 15140-122 | Antibiotic |
| Poly-L-Lysine | SIGMA | P1399 | Coverslip coating |
| Papain | SIGMA | P4762-1G | Enzyme |
| Bovine Serum Albumin | SIGMA | A3294-100G | Serum |
| Hibernate A low fluorescence media | Brain Bits Ltd | HALF | Cell Transport media |
| Dulbeccos Modified Eagles Medium (DMEM) | Biochrom | F0435 | Glial Culture Buffer |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biochrom | S0115 | Serum |
| Trypsin / EDTA | Biochrom | L2163 | Enzyme |
| Fine Tip Pasteur Pipette | Neo Labs | – | Used for trituration of cells |
| 24-well plates | BD | 353047 | Culture plate |
| 50 mL Falcon tubes | BD | 352070 | – |
| 15 mL Falcon tubes | BD | 352096 | – |
| Glass coverslips: 12 mm round | Roth | P231.1 | – |
| 35 mm Petri dish | Corning | 353001 | – |
| 100 mm Petri dish | Corning | 353003 | – |
| 30 µm CellTrics Cell Sieve | sysmex | 04-004-2326 | To remove cell clumps before cell sorting |
| Round bottom polystyrene tubes | BD | 352054 | Transport tube for sorted cells |
| Round bottom polypropylyne tubes | BD | 352063 | Collection tube for sorted cells |
| Cell culture inserts – 0.4 µm transparent PET | Falcon | 353 095 | For the co-culture of neurons and glia |
| Extra fine Bonn Scissors | Fine Scientific Tools | 14084-08 | To remove overlying skin and bone of mice |
| Extra narrow Scissors | Fine Scientific Tools | 14088-10 | To remove overlying skin and bone of rats |
| Forceps | Fine Scientific Tools | 11242-40 | To hold the head in place |
| Spatula (130 mm long / 5 mm tip width) | Fine Scientific Tools | 3006.1 | To remove the brain to filter paper |
| Scalpel Blades | Swan-Morton | #0308 | To mechanically dissociate neural tissue |
| Haemocytometer (Neubauer Imroved) | Optik Labor | – | To cell count dissociated cells |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/LS-1G | To excite TdTomato |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FHS/EF-4R2 | Td Tomato compatible emission filter |
| Fluorescent Miners Goggles (excitation light) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/ULS-02B2 | To excite Venus |
| Fluorescent Miners Goggles (emission filter) | Biological Laboratory Equipment Maintenance and Servce Ltd (BLS) |
FS/TEF-3GY1 | Venus compatible emission filter |
| Mouse-Anti-GFP primary antibodies | UC Davis | 75-132 | To enhance Venus signal following fixation |
| Mouse-Anti-GFAP primary antibodies | SIGMA | G-3893 | The identification of reactive astrocytes |
| Rabbit-Anti-CD11b primary antibodies | Southern Biotech | 1561-15 | The identification of microglial cells |
| Rabbit-Anti-MBP primary antibodies | Millipore | AB980 | The identification of oligodendrocyes |
参考文献
- Radcliff, G., Jaroszeski, M. J. Basics of flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 91, 1-24 (1998).
- Feher, K., Kirsch, J., Radbruch, A., Chang, H. D., Kaiser, T. Cell population identification using fluorescence-minus-one controls with a one-class classifying algorithm. バイオインフォマティクス. 30 (23), 3372-3378 (2014).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Adan, A., Alizada, G., Kiraz, Y., Baran, Y., Nalbant, A. Flow cytometry: basic principles and applications. Critical Reviews in Biotechnology. 37 (2), 163-176 (2017).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Turko, P., Groberman, K., Browa, F., Cobb, S., Vida, I. Differential Dependence of GABAergic and Glutamatergic Neurons on Glia for the Establishment of Synaptic Transmission. Cerebral Cortex. , (2018).
- Uematsu, M., et al. Quantitative chemical composition of cortical gabaergic neurons revealed in transgenic venus-expressing rats. Cerebral Cortex. 18, 315-330 (2008).
- Goebbels, S., Bormuth, I., Bode, U., Hermanson, O., Schwab, M. H., Nave, K. -. A. Genetic targeting of principal neurons in neocortex and hippocampus of NEX-Cre mice. Genesis. 44, 611-621 (2006).
- Banker, G. A. Trophic interactions between astroglial cells and hippocampal neurons in culture. Science. 209, 809-810 (1980).
- Lindsay, R. M. Adult rat brain astrocytes support survival of both NGF-dependent and NGF-insensitive neurones. Nature. 282 (5734), 80-82 (1979).
- Geissler, M., et al. Primary hippocampal neurons, which lack four crucial extracellular matrix molecules, display abnormalities of synaptic structure and function and severe deficits in perineuronal net formation. Journal of Neuroscience. 33 (18), 7742-7755 (2013).
- Wang, Y., et al. Fluorescent labeling of both gabaergicand glycinergic neurons in vesicular GABA transporter (VGAT)-venus transgenic mouse. 神経科学. 164 (3), 1031-1043 (2009).
- Höltje, M., et al. Role of Rho gtpasein astrocyte morphology and migratory response during in vitro wound healing. Journal of Neurochemistry. 95 (5), 1237-1248 (2005).
- Booker, S. A., Song, J., Vida, I. Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons. Journal of Visualized Experiments. , e51706 (2014).
- Pfrieger, F. W., Barres, B. A. Synaptic efficacy enhanced by glial cells in vitro. Science. 277 (5332), 1684-1687 (1997).
- Ullian, E. M., Sapperstein, S. K., Christopherson, K. S., Barres, B. A. Control of synapse number by glia. Science. 291, 657-661 (2001).
- Christopherson, K. S., et al. Thrombospondins are astrocyte-secreted proteins that promote CNS synaptogenesis. Cell. 120, 421-433 (2005).
- Berghuis, P., et al. Brain-derived neurotrophic factor controls functional differentiation and microcircuit formation of selectively isolated fast-spiking gabaergic interneurons. European Journal of Neuroscience. 20 (5), 1290-1306 (2004).
- Liddelow, S. A., et al. Activated microglia induce neurotoxic reactive astrocytes via Il-1α, tnfα, and c1q. Nature. 541, 481-487 (2017).
- Tomlinson, M. J., Tomlinson, S., Yang, X. B., Kirkham, J. Cell separation: Terminology and practical considerations. Journal of Tissue Engineering. 4, (2013).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
