형광 활성 세포 선별을 통해 확립 된 정제 GABAergic 또는 Glutamatergic 뉴런의 일차 세포 배양

모든 절차 및 동물 유지 관리는 제도적 지침, 독일 동물 복지 법 및 동물 보호에 관한 유럽 위원회 지침 86/609/EEC에 따라 수행 되었으며, 현지에서 허가를 받았습니다. 정부 기관 (0215). 참고: 이 프로토콜은 단일 형질 전환 쥐 또는 강아지 쥐 (출생 후 0 ~ 2)에서 정제 된 뉴런의 배양을 설명 합니다. 모든 기술은 무 균 조건 하에서 수행 되어야 한다. 모든 솔루션은 0.2 µm 필터를 사용 하 여 소독 해야 합니다 ( 재료 표참조). 유리 커버 슬립 및 해 부 도구는 185 ° c에서 3 시간 동안 열 살 균 해야 합니다. 1. 폴 리 라이 신과 코팅 유리 커버 슬립 200 µ 폴 리 라이 신 (PLL) 용액의 5Ml 분 취를 제거 하 여 유리 커버 슬립을 준비 합니다. 순수한 주입 학년 물 45 mL를 추가 하 여이 원 액을 20 µ g/mL에 희석 하십시오. 필터-용액을 새로운 50 mL 원추형 튜브로 소독 하십시오. 이 튜브를 “PLL 멸 균”으로 라벨을 부착 합니다.참고: 상 온에 저장 된 물을 사용 하 여 해 동 공정의 속도를 높일 수 있습니다. 멸 균 PLL 솔루션에 100 멸 균, 원형, 12mm 유리 커버 슬립을 추가 합니다. 심지어 코팅을 보장 하기 위해, 2 ~ 3 분에 대 한 매 5-10 분 마다 튜브를 교 반. 이 방법으로 커버 슬립을 1 시간 동안 코팅 합니다.참고: 독일에서 제조한 원형 유리 커버 슬립 (지름 = 12mm)은 안정적인 배양 표면을 제공 하 고 24 웰 세포 배양 판의 웰에 쉽게 들어갈 수 있기 때문에 선호 됩니다. PLL 코팅의 40 분 후에 티슈 페이퍼 2 개를가지고 흐름 캐비닛에 평평 하 게 놓습니다. 70% 에탄올을 사용 하 여 종이를 소독 한 다음 평평 하 게 하 여 주름을 제거 하 고 건조 상태로 둡니다. 유리 커버 슬립을 PLL로 1 시간 코팅 한 후 과량의 PLL 솔루션을 제거 하 고 멸 균 주입 등급 물을 추가 하십시오. 2 ~ 3 초 동안 커버 슬립을 부드럽게 교 미 하 여 초과 PLL의 제거를 허용 합니다. 이 헹 굼 단계를 추가로 2 회 반복 합니다. 여분의 물을 제거한 다음 커버 슬립을 멸 균 티슈 페이퍼로 옮겨 준다. 각 커버 슬립을 곡선형 핀셋으로 조심 스럽게 분리 하 고 건조 시켜 둡니다.참고: 쉽게 분리 되지 않는 커버 슬립은 폐기 될 수 있습니다. 대안적으로, 소량의 물을 첨가 하 여 분리를 도울 수 있다. 건조 한 후 커버 슬립을 24 웰 배양 플레이트에 옮겨 주세요.참고: 커버 슬립은 해 부 과정을 시작 하기 전에 약 30 분-1 시간을 준비 해야 합니다. 플레이트는 필요할 때까지 37 ° c 및 5% CO2에서 인큐베이터 에 보관할 수 있습니다. 2. 하 마 및 피 질 조직의 해리 세포 배양 용액의 제조 신경 조직의 해리에 대 한, 먼저 세포 배양 완충 액의 40 mL 분 취를 제 상 한다 (mM에서의 조성 물): 116 염화 나트륨, 5.4, 1.3 0.52ha2·1c4 · 2N·22h 및 25d 포도 당, pH = 7.4). 15 mL 원뿔형 튜브에 대 한 12 mL의 세포 배양 완충 액을 측정 하는 단계; “BSA”로 레이블. 5 mL의 세포 배양 완충 액을 다른 15 mL 튜브로 측정 하는 단계; “파파 인”으로 라벨을 지정 합니다. 37 ° c에서 15 분 동안 수조 내에 두 튜브를 배양 합니다. 나머지 세포 배양 완충 액을 필터-멸 균 하 고, 필요 시까지 4°c에서 보관 하 여 “완충 메 마른”으로 라벨을 부착 한다. 소 혈 청 알 부 민 (BSA)의 120 mg을 계량 하 고 “BSA” 라는 레이블이 붙은 튜브에 추가 합니다. 파파 인 7 mg을 무게를 내 고 튜브에 추가 합니다. 15 분 동안 수조에 두 튜브를 돌려줍니다.참고: 파파 인 분말의 전달을 용이 하 게 하기 위해 계량 보트에 소량의 버퍼를 추가 하는 것이 도움이 된다. 모든 분말이 용 해 되 면, 각 용액을 신선한 15 mL 원추형 튜브에 필터-살 균 합니다. 튜브 파파 인에 대해, 필터링 된 용액에 “파파 인-멸 균”으로 라벨을 부착 합니다. 튜브 BSA에 대 한, 3 튜브에 멸 균 BSA 솔루션을 분할, BSA 용액 4 mL를 포함 하는 각각. 각 튜브에 ‘ BSA 멸 균 ‘과 ‘ 1 ‘, ‘ 2 ‘ 또는 ‘ 3 ‘으로 라벨을 부착 합니다. 모든 튜브를 다시 수조에 반환 하 고 필요할 때까지 37 ° c에서 계속 배양 합니다. 조직 해 부를 위한 준비 35 mm 여과 지 ( 재료 표참조)를 한 장씩 복용 하 고 70% 에탄올로 소독 하십시오. 100 mm 페 트리 접시의 뚜껑을 흐르는 캐비닛에 두고 건조 시킵니다. 해 마와 피 질의 해 부에 필요한가 위, 집게, 메스 및 주걱 ( 재료 표참조)을 배치 합니다. 장소 2 35 mm 페 트리 접시와 100 mm 페 트리 접시 흐름 캐비닛의 중앙에 접근 할 수 있는 위치에 멸 균 필터 종이를 포함. 트랜스 제 닉 NexCre를 수집; Ai9 및 VGAT 금성 마우스 새끼는 해 부 해야 합니다. 적절 한 여기 및 방출 필터 ( 재료 표참조)가 있는 형광등을 사용 하 여 야생 유형 littermates의 형광 새끼를 구별 하십시오. 동물을 하 부 하기 직전에 냉장, 멸 균 세포 배양 완충 액으로 35 mm 페 트리 디쉬를 각각 채 웁 니다.참고: 한 페 트리 접시는 분리 사이의 도구를 청소 하는 것입니다, 다른 하나는 해 마와 피 질을 수집 하기 위한 것입니다. 조직 해 부 세포 배양 완충 액이 부 어 지 면 서, 출생 후 하루 0-2 형질 전환 마우스 또는 쥐 새끼 큰, 날카로운가 위를 사용 하 여 머리를 흐름 캐비닛으로 전달 하는 멸 균 100 mm 페 트리 접시를 사용 합니다. 포 셉,가 위 및 주걱을 사용 하 여 신중 하 게 형질 전환 강아지의 뇌를 멸 균 여과 지에 전달 합니다. 소 뇌를 멀리 하 고 2 반구를 분리 하는 타입 22 메스를 사용 합니다. 작은 주걱을 사용 하 여 횡 방향으로 반구를 굴려. 각 반구에서 부드럽게 아래로 눌러 피 질이 필터 종이와 접촉 하도록 합니다. 조심 스럽게 해 마와 피 질을 나타 내기 위해 중간 뇌 부위를 이동 합니다.참고: 반구에 아래로 누를 때 너무 많은 압력을 적용 하지 않도록 주의 하거나 세포가 분쇄 될 수 있다. 각 반구에서 해 마와 피 질을 분리 하는 메스 또는 주걱을 사용 합니다. 해 부 조직을 냉장 세포 배양 완충 액을 함유 하는 35 mm 페 트리 디쉬에 전달 한다.참고: 여러 동물을 하 부 하는 경우, 얼음에 50 mL 원추형 튜브에 멸 균 세포 배양 버퍼를 저장 합니다. 각각의 해 부 후, 해 부 된 조직을 냉장 세포 배양 완충 액으로 전달 한다. 코르 티코-해 마 조직의 성공적인 해 부 후, 흐름 캐비닛에 물 욕조에서 멸 균 파파 인 용액을 전송 한다. 3 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 해 부 해 마와 피 질을 멸 균 35 mm 페 트리 접시의 뚜껑으로 옮겨 준다. 조직이 작은 조각에 있을 때까지 유형 22 메스의 평평한 부분을 사용 하 여 십자 동작으로 들어온다. 소량의 파파 인 용액을 사용 하 여 페 트리 디쉬의 뚜껑 으로부터 다진 조직을 무 균 파파 인 튜브로 전달 한다. 파파 인 튜브를 수조에 반환 하 고 25 분 동안 37 ° c에서 조직을 배양 한다. 파파 인 인큐베이션 동안, 완전 한 형광 매체 용액을 구성 한다. B27의 1ml의 분 취 제를 제 상, Glutamax 및 펜 strep의 0.5 ml의 분 취 액의 0.5 ml의 분 취 액. 최대 절전 모드의 aliquot 48.5 mL은 50 mL 원뿔형 튜브에 낮은 형광 매체를 제공 합니다. B27, Glutamax 및 펜 Strep를 솔루션에 추가 합니다. 용액을 잘 흔들어 준 다음 필터 소독 하 고 “완전 한 미디어 최대 절전 모드” (날짜 및 이니셜 포함)로 라벨을 지정 합니다. 수 조에서 37 ° c에서 배양 합니다. 파파 인 배양 후, 유로 파파 인과 멸 균 BSA 튜브를 흐름 캐비닛에 전달 합니다. 1 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 파파 인 튜브에서 BSA-튜브 1로 코르 티코 해 마 조직을 제거 하십시오.참고: 과도 한 파파 인 용액의 전달을 최소화 하기 위해 주의 하십시오. 세포의 해리 조직의 큰 덩어리를 분해 하기 위해, 1 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 조직을 여러 번 트리 팅 합니다. 이 후, 미세 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 조직 7 번을 삼 출 한다. 조직에서 30 초 동안 방치 하면 더 큰 조직을 퇴적 물에 사용할 수 있습니다. 30 초 후에 BSA 튜브 1에서 BSA 튜브 2로 1 mL의 용액 및 조직을 전송 합니다. 미세 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 BSA-튜브 2 여러 번에 조직을 삼 투. Trituration 후, BSA 튜브 1에서 조직 및 용액의 낮은 1 mL를 다시 전송 하지만, 지금 BSA-튜브 3. 미세 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 BSA-튜브 3 여러 번에 조직을 삼 출. Trituration 후, BSA 튜브 1로 튜브 2 및 3에서 모든 솔루션과 조직을 전송 합니다. 3000 x g 에서 3 분간 원심 분리기를 2-3. 원심 분리 중에 완전 한 신경 기저 A 배지 (NBA 미디어)를 구성 합니다. 용 수 조에서 37 ° c에서 48.5 ml의 원뿔형 튜브에 NBA 미디어의 aliquot를 50를 배양 한다. 이 튜브에 라벨 “NBA만”. 또한, B27의 1Ml의 분 취 제를 해 동 하 고, 실 온에서의 Glutamax 및 펜 Strep의 0.5 mL의 분 취 액을 0.5. 원심 분리 후, 펠 라이 온 조직에서 상층 액을 조심 스럽게 제거 하 고 2 mL의 완전 한 배지에서 세포를 재 일시 중단 한다. P1000 파이 펫을 사용 하 여 조직을 위 아래로 20 회 트리 트 레이트 합니다.참고: 세포를 너무 세게 피 펫 팅 하지 않도록 주의 하십시오. 너무 많은 압력이가 해지면 세포가 손상 될 수 있습니다. 1 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 30 µm 세포 체를 통해 세포 현 탁 액을 폴리스 티 렌 샘플 튜브로 걸러 냅니다.참고: 세포 현 탁 액이 세포 체를 통해 즉시 통과 하지 않는 경우에, 흐름을 시작 하기 위하여 살 균 장갑을 가진 체의 꼭대기에 눌러야 할 수 있습니다. 이 중요 한 단계 는 셀 분류기의 막힘을 방지 합니다. 선별 후 뉴런을 수집 하려면 완전 한 미디어의 300 µ L을 폴 리 프로필 렌 튜브의 필요한 수로 피 펫 팅 하 여 수집 튜브를 준비 하십시오. 셀 서 스 펜 션을 정렬 하기 위해 셀 분류기로 이동 시킬 준비가 되었습니다. 샘플을 희석 해야 하는 경우에는 셀 서 스 펜 션, 여분의 수집 튜브 및 여분 미디어를 가져가 라. 3. 정제 된 GABAergic 또는 Glutamatergic 뉴런의 세포 분류 참고: 선별 하는 동안 세균 오염의 가능성을 최소화 하기 위해 선별 기의 샘플 튜브를 70% 에탄올로 헹 구 어 정렬 하기 전에 5 분 이상. 상세한 정렬 매개 변수는 계측기 마다 다르며 근본적인 고려 사항은 다음과 같습니다. 첫 번째 셀 정렬 중에 야생 유형 동물의 세포를 정렬 하 고 비교 하 여 레이블이 없는 셀에서 배경 형광 수준을 설정 합니다. 정렬할 각 형광 셀 유형에 대해 적절 한 여기 및 방출 필터를 선택 합니다. 각각 488 nm 또는 531 nm 여기 파장을 사용 하 여 금성 및 TdTomato 단백질을 자극 합니다. 530/40 및 575/30 방출 필터 세트를 통해 방출 된 빛을 각각 감지 합니다. 완전 한 매체의 300 μ l를 포함 하는 폴 리 프로필 렌 수집 튜브를 세포 수집을 위한 셀 분류기에 추가 하십시오. 고 순도의 경우, 밝게 표시 된 형광 셀을 정렬 하십시오 ( 그림 1b 참조: 정렬 된 셀의 도트 플롯). 정렬 후 최적의 결과를 위해 정렬 된 셀의 순도 테스트를 수행 하 여 순도 수준을 추정 합니다. 정렬 다음의 일반적인 셀 회수율은 70 ~ 80%입니다. 각 수집 튜브에 정렬 된 셀 수를 기록해 둡니다. 이 값은 셀 정렬 도구에 의해 주어진 다.참고: 셀 정렬은 70 µm 노즐 (70 psi 보호관 유체 압력) 또는 100 µm 노즐 (20 psi 외피 유체 압력)을 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 4. 정렬 된 뉴런의 배양 셀 선별 후, 1 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 수집 된 세포를 2 mL 둥근 바닥 원심 분리기 튜브로 옮깁니다. 세포를 3 분간 3000 x g 에서 원심 분리 하 여 세포 펠 렛을 형성 한다.참고: 셀 펠 렛의 위치를 식별 하는 데 도움이 되도록 둥근 바닥 원심 분리기 튜브를 바깥쪽으로 향하게 하 여 뚜껑의 힌지 (즉, 튜브의 동일한 측면에서 힌지로)를 원심 분리기 튜브 뒤쪽에 형성 할 수 있습니다. 원심 분리 하는 동안 B27 0.5, Glutamax 및 펜 Strep의 0.5 ml의 1 mL을 미리 데워 진 NBA 미디어의 48.5 mL에 추가 하십시오. 용액을 잘 흔들어 다음 멸 균 및 라벨을 “NBA 완료 미디어” (날짜 및 이니셜 포함)로 표시 합니다. 필요할 때까지 물 목욕으로 돌아가십시오. 원심 분리 후, 1 mL 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 상층 액을 다른 원심 분리기 튜브로 이송 (세포 펠 렛이 교란 된 경우 상 등 액을 유지 한다). 1000 셀/µ의 세포 밀도를 달성 하기 위해 미리 데워 진 완전 한 NBA 미디어의 필요한 양으로 세포 펠 렛을 재 일시 중단 하 고 P200 또는 P1000 파이 펫을 사용 하 여 위아래로 파이 펫 팅 하 여 세포를 재 정지 시킵니다. 해리 된 세포의 존재를 확인 하려면 4 배 또는 10 배 대물 렌즈를 사용 하 여 현미경으로 세포 용액을 확인 하십시오. 대안적으로, 커버 슬립 상에 소량의 세포 용액을 파이 펫 팅 하 고 현미경 하에서 확인 한다. 다 수의 세포가 존재 하는 경우에, 4.3 단계의 상층 액은 폐기 가능 하다. 세포를 도금 하기 전에 2 ~ 3 초 동안 중간 속도로 소용돌이를 하 여 균일 한 세포 현 탁 액을 보장 한다. Vortexing에 따라, 셀 현 탁 액의 10 µ L을 각 커버 슬립의 중심으로 신속 하 게 피 펫 팅 합니다. 세포를 피 펫 팅 한 후 각 플레이트를 인큐베이터 (5% CO2/37 ° c)로 신속 하 게 복귀 하 고 1 시간 동안 배양 합니다.참고: 여러 개의 24 웰 플레이트에 셀을 추가 하는 경우, 플레이트 사이에 세포를 볼 텍 싱 하 여 균일 한 세포 밀도를 보장 합니다. 1 시간 후, 미리 따뜻하게 완전 한 NBA 미디어의 500 µ L로 세포를 공급 하 고 인큐베이터로 돌아갑니다.참고: 세포를 공급할 때 세포 분리를 피하기 위해 매체를 우물의 측면 아래로 부드럽게 피 펫 하는 것이 중요 합니다. 짧은 실험 (< 16 일)의 경우, 상기 밀도에서 먹이는 것은 필요 하지 않습니다. 더 큰 밀도의 세포를 도금 할 때 더 빈번한 급지 간격이 필요할 수 있습니다 ( 토론참조). 5. 성상 세포 강화 신경 교 지원 배양 물 참고: 신경 교 배양14 의 제조 및 세포 배양 삽입물의 사용은 이전에 기술 되었다12. 간단히 말해, 농축 된 아 교 세포 배양 글 리아는 코 티코-하 마 조직 으로부터 유래한 다 (meninges 제거 됨; P2-P5), 20 µ의 PLL 코팅 6 웰 플레이트에서 일주일 동안 배양 되었으며, DMEM 배지를 보충 한 혈 청. 정제 된 뉴런 및 신경 교 세포를 공동 배양 하기 위해, 필요한 수의 세포 배양 삽입 (0.4 µm 기 공 크기에 대 한 교 활 신경 교 세포를 통로- 물질 표참조). 세포를 통과 시키기 위해, 부 화기 로부터 confluent 신경 교 세포를 함유 하는 6 웰 플레이트를 제거 하 고 2 개의 웰 스를 2 회 세척 한 후, 2 mL의 미리 따뜻하게 (37) 인산 완충 식 염 수 (PBS)를 사용 한다. PBS 용액을 흡 장 하 고 P1000 피 펫을 사용 하 여 미리 데워 진 (37°c) 트립 신 (1:250)/EDTA (0.25%/0.02%) 각 웰에 대 한 해결책. 6 웰 플레이트를 인큐베이터에 반납 하 고 세포 분리를 위해 2 ~ 3 분 간격으로 점검 합니다. 중요 한 세포 분리가 발생 한 후에는 미세 팁 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 세포 및 세포 용액을 부드럽게 위아래로 피 펫 하 여 개별 세포를 더 분리 하 고 분리할 수 있도록 돕습니다. 셀 용액을 15 mL 원추형 튜브로 전송 하 고 3 분 동안 3000 x g 에서 원심 분리기로 이동 합니다. P1000 피 펫을 사용 하 여 세포를 재 일시 중단 하 고 미리 데워 진 (37 ° c) NBA 완전 배지는 셀 펠 렛이 용액에 있을 때까지 위아래로 부드럽게 파이 펫 팅을 수행 합니다. 하 모 세포종 또는 자동화 된 세포 카운터를 사용 하 여 세포 수를 수행 합니다.참고: 문화 7 일 후 약 750000-1000000 세포는 6 웰 플레이트의 각 웰에서 수확 할 수 있습니다. 4만의 각 세포 배양 액을 500 µ L 방울 (80 세포/µ L)에 삽입 하는 교 신경 세포. 세포가 1 시간 동안 부착 되도록 허용한 후, 멸 균 포 셉을 사용 하 여 정제 된 뉴런을 포함 하는 24 웰 플레이트에 신경 교 피복 세포 배양 삽입물을 전달 한다. 세포 배양 삽입물 (약 300 µ L)의 표면에서 과잉 배지를 제거 한다.참고: 기포가 종종 세포 배양 삽입물 아래에 갇 히 게 될 수 있으므로, 삽입을 부드럽게 기울여 이러한 기포를 분리 해야 할 수 있습니다. 더 많은 신경 교 세포가 세포 배양 삽입물에 첨가 되는 경우, 추가적인 세척 및 원심 분리기 단계는 세포 생존에 유해할 수 있는 과잉 트립 신을 제거 하기 위해 요구 될 수 있다.