胸腺标本分离和鸡刺激器官的形成

20世纪70年代初, le douarin 开发了一个优雅的鹌尾鸡嵌合体系统, 为了解细胞迁移和细胞相互作用在发育^过程中的作用开辟了新的途径 1^,2。该模型是在两个物种之间的细胞交换不会明显干扰胚胎发育的前提下设计的, 后来在用于研究包括神经和造血在内的许多发育过程时得到了证实系统¹。以后者为例, 首次利用鸡嵌合体系统3观察到了造血祖细胞对胸腺上皮雏形进行殖民的循环波.为此, 胸腺的预期区域, 即第三和第四咽袋 () 的内胚层, 在15至 30-sy像中阶段从鹌鹑 (q) 胚胎中进行了机械和酶分离 [胚胎日 (e) 1.5-e2.5]。这些阶段对应于鸡汉堡包和 hamilton⁴ (hh)-阶段12-17。隔离程序从使用胰蛋白酶开始, 将内皮从附着的中生酶中分离。分离的内皮在 e3-e3.5 (hh 级 20-21) 被移植到宿主鸡 (c) 胚胎的体细胞区域。这种异源间质被认为是胸腺上皮发育的 “允许”, 也有助于器官的形成 3.随后, 鸡寄主血液传播祖细胞的连续波浸润到鹌鹑供体胸腺上皮对应体^,有助于宿主胚胎3的胸腺形成。

最近, 这种方法的改进版本也被证明是重要的研究上皮-间充质相互作用的早期阶段胸腺 5.在这方面, 参与嵌合胚胎3中异位胸腺形成的组织从供体胚胎和宿主胚胎中分离, 并在体内相关。采用改进的方案分离了鹌鹑 (e2.5-e3) 和鸡生长激素中胚层 (e2.5-e3)。简单地说, 胚胎组织通过显微手术分离, 并进行体外胰腺素消化。并根据组织类型和发育阶段优化了酶消化条件、培养温度和培养时间 (表 1)。

其次, 分离的组织在一个组织型的体外系统中联系 48小时, 如^{先前报道的 5,6}。组织的体外关联模仿胚胎中的局部细胞相互作用, 克服了体内操作的一些限制。该系统对于研究复杂形态发生事件中的细胞相互作用特别有用, 例如咽部设备的开发。

可以使用 cam 方法 (以前详细的^5,7, 8⁾进一步探讨每个组织在胸腺组织发生中的作用, 以及异种协会产生胸腺的能力。简单地将培养的组织嫁接到 ce8 胚胎的 cam 中, 并允许在体内发育10天。然后, 通过对采集的外植体进行形态学分析, 评价胸腺的形成。与经典的鹌鹑研究³一样, 鹌鹑胸腺上皮被来自鸡胚胎的造血祖细胞 (hpc) 殖民, 后来被证明有助于器官发育^9,10.hpc 通过高度血管化的 cam 5^、7、8从胚胎迁移到异位嵌合胸腺。鹌鹑源性胸腺上皮可以通过免疫组织化学使用物种特异性抗体 (即 qcpn-mab 鹌鹑环核) 进行鉴定, 克服了对组织特异性分子标记的需求。

这种实验方法, 正如在以前的出版物⁸中报告的两步方法, 允许调节信号通路通过定期给药剂在体外和奥沃发展。此外, 外植体可以在实验过程的任何时间点收获 8.

最后, 这里详细的隔离协议允许保存胚胎组织的自然特性和三维结构, 特别是用于详细说明胚胎领土的原位基因表达模式, 否则无法进入常规方法。此外, 转录组分析方法, 包括 rna-seq 或微阵列, 也可以应用于孤立的组织, 而不需要遗传标记, 同时提供组织特异性高通量 “组学” 分析。