Нержавеющая протокол для высокого качества изоляции РНК от лазерного захват клеток Пуркинье Microdissected мозжечка человека Post-Mortem

Лазерная захвата microdissection (LCM) является ценный исследовательский инструмент, который позволяет разделение патологически соответствующих клеток для последующей оценки молекулярно приводом. Использование молекулярного анализа образцов этих разнородных тканей и корреляции с патологическим и клинических данных является необходимым шагом в оценке трансляционная значение биологических исследований¹. При анализе данных выражение гена РНК, использование разделов замороженные ткани очень рекомендуется, так как она позволяет за отличное качество РНК, а также максимальным количеством². Хорошо известно, что высокое качество и количество РНК необходимы для значимых данных от РНК последовательности³. Однако при использовании РНК из ткани свежий замороженные посмертные для LCM, РНК деградации является серьезной проблемой, как это происходит сразу же после смерти и его степени опосредовано различные факторы, связанные с ткани коллекции метод^4,5 . Кроме того РНК деградации усугубляется, когда методы окраски необходимо признать гистологических детали и идентификации клетки. Специализированных пятная методы, такие как гематоксилином и эозином, Ниссль пятно, иммунофлюоресценции и иммуногистохимии полезны в дифференциации клеток от окружающих стромы, но было показано, снизить РНК и изменить выражение Стенограмма ⁶профилей. Таким образом наша лаборатория создала нержавеющей протокол, специально предназначенных для сохранения РНК человека мозжечка посмертные для целей РНК последовательности после изоляции LCM Пуркинье нейронов.

В обработке свежий замороженные ткани для LCM, метод фиксации переменно может повлиять на целостность РНК и тканей. Формалин фиксации стандартный морфологический сохранения, но причины cross-linking который может фрагмент РНК и мешать амплификации РНК⁷. Фиксация этанол является лучшей альтернативой для изоляции РНК, как это коагуляционное фиксатором, который не побудить сшивки¹. Для лучшей визуализации тканей морфологии, ксилол является лучшим выбором, как она удаляет липиды из ткани. Однако существуют известные ограничения при использовании ксилола в НОК, как ткани могут высохнуть и стать хрупкими вызывая ткани фрагментации после лазерной захвата⁷. Ксилол также летучих токсин и должно быть правильно обработаны в зонта. Тем не менее ксилол было показано для улучшения визуализации тканей, сохраняя при этом целостность РНК⁸. Таким образом наш протокол центров вокруг 70% этанол фиксации и дегидратации этанола, следуют ксилол инкубации для морфологических ясность.

Важно обратить внимание на различные виды microdissection лазерных систем, как они показали отличаются в скорости, точности и качества РНК. Инфракрасный (ИК) лазерный захватить microdissection и ультрафиолетового (УФ) Лазерные Микролучевой microdissection системы были оба романа LCM платформ, которые почти одновременно появились⁸. IR-LCM система использует «контактной системы» с помощью прозрачная пленка из термопластичного помещены непосредственно на участке ткани, и клетки интереса выборочно придерживаться фильм сосредоточены импульсы от ИК-лазер. Кроме того система УФ-НОК является «система-контакт», whereby сфокусированного лазерного пучка порезы от клетки или регионы интереса в ткани; в зависимости от конфигурации в двух имеющихся в настоящее время коммерческих платформ, использующих либо прямой или инвертированный микроскоп дизайн ткани приобретается в коллекции устройство по лазерно индуцированным давления волны, что катапульты против силы тяжести или ткани собранные под действием силы тяжести, соответственно. Значительные преимущества УФ-LCM системы включают в себя быстрее клеток приобретения, свободной от загрязнения коллекции с бесконтактным подхода и более точного рассечение из-за гораздо меньшие лазерный луч диаметром⁹. Этот протокол был разработан специально для системы УФ-LCM и не тестировался в системе ИК-НОК. В конструкции системы либо УФ-НОК когда накопления клеток в коллекции колпачок, использование coverslip, улучшает сотовых ясность при микроскопии не подходит, как клетки не сможет вступить в коллекции Кап. Таким образом чтобы повысить визуализации тканей, мы протестировали использование непрозрачной коллекции шапки, которые призваны выступать в качестве coverslip для микроскопических визуализации в системах УФ-НОК, против жидкости заполнены коллекции шапки. Колпачков жидкости заполнены коллекции может быть сложным, как жидкость подлежит испарения и должны быть заменены часто во время работы в Микроскоп. Время становится важным фактором стабильности РНК, как захваченных ткани растворяет сразу⁷.

Наша лаборатория изучает посмертных neuropathologic изменения в мозжечке больных с необходимым тремор (ET) и смежных нейродегенеративных расстройств мозжечка. Мы продемонстрировали морфологических изменений, сосредоточены на клетки Пуркинье, которые отличают ET дела против контроля, в том числе уменьшение количества клеток Пуркинье, увеличение дендритных регрессии и разнообразные аксональное изменений, ведущих нас постулат что Пуркинье дегенерации клеток является основной функцией биологических ET патогенеза^10,11,12,13. Транскрипционный анализ профиля используется во многих неврологических заболеваний исследовать основные молекулярные основы дегенеративных клеточных изменений. Однако транскрипционный анализ профилей из гетерогенных образцов, таких как ткани областях мозга, могут действенно маска выражение низкой изобилие стенограммы и/или уменьшить обнаружения молекулярных изменений, которые происходят только в небольшой численностью населения пострадавших клеток, таких как клетки Пуркинье в коре мозжечка. Например клетки Пуркинье значительно превосходили клетками обильные гранул в коре мозжечка, приблизительно в избытке; Таким образом чтобы эффективно целевой их транскриптом требует конкретных изоляции этих нейронов. Коры мозжечка, разделенное на различные слои, которые отличаются в ячейке плотность и размер ячейки. Эта Сотовая архитектура идеально подходит для визуализации в образец ткани, свежемороженая без красителя содержащих окрашивание реагентов. В теории, этот протокол может также применяться к другим типам ткани, которые имеют аналогичные отличительные ткани Организации.

Этот протокол был разработан для работы специально для визуализации клеток Пуркинье в мозжечок человека посмертные. Для фиксации, окрашивание визуализации и РНК сохранение многих видов тканей для целей из обоих ИК – и УФ-LCM существуют многочисленные протоколы. При созерцая экспериментальный дизайн для УФ-НОК, лиц следует адаптировать их протокол для наилучшего нужд и потребностей, начиная и заканчивая материалы. Здесь мы объединяем многие аспекты различных протоколов LCM, чтобы предоставить метод расширения для визуализации клеток Пуркинье трупа человека мозжечка без необходимости краски, содержащие окрашивание реагентов для подготовки высококачественных РНК транскриптом последовательности.