Ein Edelstahl-Protokoll für hochwertige RNA Isolation aus Laser Capture Microdissected Purkinje-Zellen im menschlichen Post-Mortem Kleinhirn

Laser Capture Microdissection (LCM) ist eine wertvolle Recherche-Tool, die die Trennung der pathologisch relevanten Zellen für Molekular angetriebenen Folgebewertung ermöglicht. Die Verwendung von molekularen Analysen in dieser heterogenen Gewebeproben und die Korrelation mit pathologischen und klinischen Daten ist ein notwendiger Schritt bei der Bewertung der translationalen Bedeutung der biologischen Forschung¹. Bei der Analyse der Genexpressionsdaten aus RNA die Verwendung von gefrorenen Gewebeschnitte wird dringend empfohlen, denn es ermöglicht eine ausgezeichnete Qualität der RNA sowie Menge²maximiert. Es wurde auch festgestellt, dass hohe Qualität und Quantität der RNA Voraussetzung für aussagekräftige Daten aus RNA Sequenzierung^{3 sind}. Jedoch ist bei Verwendung von RNA aus frisch gefrorenen Post Mortem Gewebe für LCM RNA-Abbau eine große Herausforderung, da es sofort nach Tod tritt und seine Ausdehnung wird durch verschiedene Faktoren im Zusammenhang mit dem Gewebe Sammlung Methode^{4,5 vermittelt} . Darüber hinaus ist RNA-Abbau noch verschärft, wenn befleckenden Techniken erforderlich sind, um histologische Details und Zelle Identifikation zu erkennen. Spezialisiert, Färbetechniken wie Hämatoxylin und Eosin, Nissl Fleck, Immunfluoreszenz und Immunohistochemistry sind hilfreich bei der Differenzierung von Zellen aus umgebenden Stroma aber haben gezeigt, dass RNA abgebaut und Protokoll-Ausdruck ändern Profile-⁶. Daher hat unser Labor ein Edelstahl Protokoll speziell für RNA in Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn für die Zwecke der RNA Sequenzierung nach LCM Isolierung des Purkinje Neuronen erhalten erstellt.

Bei der Verarbeitung von frischen gefrorenen Gewebes für LCM, beeinflussen die Befestigungsmethode variabel RNA und Gewebe Integrität. Formalin-Fixierung ist standard für morphologische Erhaltung, aber Ursachen Vernetzung, die möglicherweise fragment RNA und RNA Amplifikation⁷stören. Ethanol-Fixierung ist eine bessere Alternative zur RNA-Isolierung, wie es ein coagulative Fixiermittel, die nicht vernetzende¹induziert wird. Um die Darstellung der Morphologie der Gewebe zu erhöhen, ist Xylol die beste Wahl, da es Fette aus dem Gewebe entfernt. Allerdings gibt es Grenzen bekannte bei Xylol in LCM, wie das Gewebe können austrocknen und spröde verursacht Gewebe Fragmentierung auf Laser Capture⁷geworden. Xylol ist auch ein flüchtiger Toxin und muss in einer Dampfhaube richtig behandelt werden. Xylol ist dennoch nachweislich um Gewebe Visualisierung Beibehaltung auch RNA Integrität⁸zu verbessern. Daher konzentriert sich unser Protokoll auf die Verwendung von 70 % Ethanol Fixierung und Ethanol Dehydrierung, gefolgt von Xylol Inkubation für morphologische Klarheit.

Es ist wichtig, die verschiedenen Arten von lasergestützten Mikrodissektion Systeme, beachten, wie sie gezeigt haben, unterscheiden sich in Geschwindigkeit, Präzision und RNS-Qualität. Infrarot (IR) Laser capture Mikrodissektion und ultravioletten (UV) Laser Microbeam Microdissection Systeme waren beide neuartigen LCM-Plattformen, die fast gleichzeitig⁸entstanden. Die IR-LCM-System nutzt eine “Kontakte-System” mit einer transparenten thermoplastischen Folie direkt auf das Gewebe-Abschnitt platziert, und Zellen von Interesse gezielt einhalten des Films durch gezielte Impulse aus einem IR-Laser. Alternativ ist das UV-LCM-System ein “non-Contact-System”, wobei ein fokussierten Laserstrahl entfernt die Zellen oder Regions of Interest im Gewebe schneidet; abhängig von der Konfiguration in zwei derzeit verfügbaren kommerziellen Plattformen, die entweder eine invertierte oder aufrechte Mikroskop-Design verwenden, Gewebe wird in einer Sammelvorrichtung durch eine Laser-induzierte Druckwelle, die es gegen die Schwerkraft katapultiert erworben oder Gewebe ist gesammelt durch die Schwerkraft, beziehungsweise. Wesentliche Vorteile des UV-LCM-Systems zählt schneller Zelle Erwerb, kontaminationsfrei Sammlung mit dem berührungslosen Ansatz und genauere Zergliederung durch eine viel kleinere Laser Beam Durchmesser⁹. Dieses Protokoll wurde speziell für ein UV-LCM-System und nicht in einem IR-LCM-System getestet wurde. In beiden UV-LCM-System-Design wenn Anhäufung Zellen in die Sammlung-Kappe, die Verwendung von einem Deckgläschen, die verbessert ist zellulären Klarheit während Mikroskopie nicht geeignet, da die Zellen nicht in der Lage, die Sammlung GAP einzugehen wäre. Daher haben wir getestet um Gewebe Visualisierung zu erhöhen, die Verwendung von undurchsichtigen Sammlung Caps, die als ein Deckglas für mikroskopische Visualisierung in UV-LCM-Systeme gegen Flüssigkeit gefüllte Sammlung Kappen dienen sollen. Flüssigkeit gefüllten Sammlung Kappen können schwierig sein, da die Flüssigkeit unterliegt der Verdunstung und häufig während der Arbeit am Mikroskop ausgewechselt werden. Zeit ist ein wichtiger Faktor für RNA-Stabilität, wie das aufgenommene Gewebe sofort⁷auflöst.

Unser Labor untersucht die Post-mortem neuropathischem Änderungen in das Kleinhirn von Patienten mit essentiellem Tremor (ET) und verwandte neurodegenerativen Erkrankungen des Kleinhirns. Wir haben gezeigt, dass morphologische Veränderungen auf Purkinje-Zellen, die ET Fällen im Vergleich zu Kontrollen, einschließlich einer reduzierten Anzahl von Purkinje-Zellen unterscheiden zentriert dendritischen Regression und eine Vielzahl von axonale Veränderungen führt uns zu postulieren, dass Purkinje Zelldegeneration ist eine biologische Kernfunktion ET Pathogenese^10,11,12,13. Transkriptionelle Profilierung wurde in viele neurologische Erkrankungen eingesetzt, um die zugrunde liegenden molekulare Grundlagen der degenerativen Zellveränderungen zu erkunden. Doch transcriptional Profile aus heterogenen Proben, wie Gewebe Hirnregionen, können wirksam Maske den Ausdruck der niedrigen Fülle Transkripte und/oder vermindern die Erkennung von molekularen Veränderungen, die nur in eine kleine Population von betroffenen auftreten Zellen, wie Purkinje-Zellen im Kleinhirn Kortex. Beispielsweise sind der Purkinje-Zellen erheblich durch die reichlich Granulat-Zellen im Kleinhirn Cortex von ca. 1:3000 Unterzahl; so effektiv auf erfordert ihre Transkriptom spezielle Isolierung dieser Neuronen. Zerebelläre Kortex ist durch unterschiedliche Schichten abgegrenzt, die in Zelle Dichte und Größe der Zellen unterscheiden. Diese zellulären Architektur ist ideal, um in eine Tiefkühlfrische Gewebeprobe ohne Farbstoff-haltigen Färbung Reagenzien zu visualisieren. In der Theorie könnte dieses Protokoll auch angewendet werden, auf anderen Gewebetypen, die ähnlich markanten Gewebe haben Organisation.

Dieses Protokoll wurde entwickelt, um speziell für Purkinje Zelle Visualisierung im Post-Mortem-menschlichen Kleinhirn zu arbeiten. Zahlreiche Protokolle gibt es für die Befestigung, Visualisierung und RNA Erhaltung vieler Arten von Geweben für die Zwecke der beiden IR und UV-LCM Färbung. Wenn ein experimentelles Design für UV-LCM erwägen, sollten Einzelpersonen ihr Protokoll passen am besten die Bedürfnisse und Anforderungen von beginnend und endend Materialien anpassen. Hier verbinden wir viele Aspekte der verschiedenen LCM-Protokolle ermöglichen eine verbesserte Methode zur Visualisierung von Purkinje-Zellen im menschlichen Kleinhirn Post-Mortem-ohne die Notwendigkeit des Farbstoffes mit Färbung Reagenzien, qualitativ hochwertige RNA Transkriptom vorzubereiten Sequenzierung.