Измерения одного липосом для изучения Протон насосные мембранных ферментов с использованием электрохимии и Флюоресцентная микроскопия

На уровне ансамбля или macroscale с населением фермента в тысяч до миллионов молекул, где измерения представляют среднестатистический обычно информации о механизмах фермента и кинетика. Это известно, однако, что сложные макромолекулы как ферменты могут демонстрировать разнородность в их поведении и молекулярные механизмы на уровне ансамбля не обязательно верны для каждой молекулы. Такие отклонения в масштабе отдельных молекулы были широко подтверждены исследования одного ферментов с различными методами, возникающих в ходе последних двух десятилетий¹. В частности флуоресценции обнаружения отдельных ферментативной активности был использован для расследования гетерогенность ферментов активность^2,3 или обнаружить эффект так называемой памяти (периоды преуспело в периоды низкой активности высокой ферментов активность и наоборот)^4,5.

Многие исследования одного фермента требуют, что ферменты иммобилизованных на поверхности или пространственно фиксированной в еще один способ оставаться достаточно долго, в поле зрения для непрерывного наблюдения. Было показано, что фермент инкапсуляции в липосомах включить иммобилизации фермента и предотвращения любых негативных последствий из-за поверхность фермента или белок белковых взаимодействий^6,7. Кроме того липосомы предлагают уникальную возможность для изучения одного мембранных белков в их естественный липидный бислой окружающей среды^8,9,10.

Класс мембранных белков, транспортеры, осуществляет направленного транслокации веществ через клеточную мембрану, поведение, которое можно изучать только когда белки будут преобразованы в липидных бислоев (например, липосомы)^{11, 12,13}. Например Протон транслокации, выставлены несколько ферментов цепи переноса электронов прокариот и эукариот, играет важную роль в клеточное дыхание, создавая Протон движущая сила используется для синтеза АТФ. В этом случае Протон, насосные деятельность сочетается электрона передачи, хотя детальный механизм этого процесса часто ускользает.

Недавно мы продемонстрировали возможность флуоресцентного обнаружения пара с электрохимии для изучения Протон накачки активность ферментов одного терминала убихинола оксидазы Escherichia coli (цитохромы Бо₃) Восстановленный в липосомах¹⁴. Это было достигнуто путем инкапсуляции рН чувствительной мембраны непроницаемый Люминесцентную краску в Люмене липосомы, подготовленных от э. coli полярных липидов (рис. 1A). Количество белка был оптимизирован так, что большинство липосомы либо содержащиеся не или только одна молекула восстановленный фермента (в зависимости от распределения Пуассона). Два субстратов цитохрома Бо₃ были предоставлены путем добавления убихинон смесь липидов, который сформировал липосомы и кислорода (окружающей среды) в растворе. Липосомы затем малонаселенных адсорбированные на полупрозрачных Сверхплавное золото электрода, покрытые собственн-собранные монослоя 6-mercaptohexanol. Наконец электрод монтируется на нижней части простого spectroelectrochemical клеток (рис. 1B). Электрохимический управления хиноны бассейн окислительно-восстановительного состояния позволяет гибко запустить или остановить ферментативной реакции в любой момент, в то время как рН чувствительных краска используется для мониторинга изменений рН внутри просвета липосомы результате Протон транслокации, ферменты. С помощью интенсивности флуоресценции второй, липидов прыгните Люминесцентную краску, размер и объем отдельных липосомы могут определяться и таким образом количественной фермента Протон, насосные деятельности. Используя эту технику, мы особенно обнаружили, что цитохромы Бо₃ молекулы способны войти в состояние спонтанной утечки, что быстро рассеивается Протон движущей силой. Цель этой статьи заключается в внедрения метода измерений одного липосомы в деталях.