Mesures de Liposome unique pour l’étude des Enzymes membranaires Proton-pompage, à l’aide de l’électrochimie et microscopie fluorescente

Informations sur les mécanismes enzymatiques et cinétique sont généralement obtenues au niveau d’ensemble ou échelle macroscopique avec population enzyme par milliers à des millions de molécules, où les mesures représentent une moyenne statistique. On sait, toutefois, que des macromolécules complexes telles que les enzymes peuvent démontrer hétérogénéité dans leur comportement et mécanismes moléculaires observés au niveau de l’ensemble ne sont pas nécessairement valables pour chaque molécule. Ces écarts sur l’échelle de la molécule individuelle ont été largement confirmés par des études sur les enzymes unique avec une variété de méthodes émergent pendant les dernières deux décennies¹. Notamment, la détection par fluorescence de l’activité enzymatique individuels a été utilisée pour étudier l’hétérogénéité de l’activité d’enzymes,^2,3 et découvrez l’effet de mémoire ce qu’on appelle (périodes d’activité d’enzymes élevés ont réussi par des périodes de faible activité et vice versa)^4,5.

De nombreuses études seule enzyme exigent que les enzymes sont immobilisées sur la surface ou dans l’espace fixe dans une autre façon de rester suffisamment longtemps dans le champ de vision pour l’observation continue. Encapsulation d’enzyme dans des liposomes a été démontrée pour permettre l’immobilisation d’enzymes tout en empêchant toute incidence négative due la surface enzymes ou protéines interactions^6,7. En outre, les liposomes offrent une possibilité unique pour étudier les protéines de la membrane unique dans leur naturelle lipidique bi-couche environnement^8,9,10.

Une classe de protéines membranaires, transporteurs, exerce une translocation directionnelle des substances à travers la membrane de la cellule, un comportement qui ne peut être étudiée lorsque les protéines sont reconstituées dans les lipides des bicouches (p. ex., liposomes)^{11, 12,13}. Par exemple, translocation des protons, exposée par plusieurs enzymes des chaînes de transport d’électrons procaryotes et eucaryotes, joue un rôle important dans la respiration cellulaire en créant une force proton-motrice utilisée pour la synthèse d’ATP. Dans ce cas, le proton de l’activité de pompage est couplé au transfert d’électron, bien que les modalités de ce processus souvent demeure insaisissable.

Récemment, nous avons démontré la possibilité de détection par fluorescence couple avec électrochimie pour étudier l’activité des enzymes unique de l’oxydase d’ubiquinol terminal d’ Escherichia coli ( bo₃du cytochrome) de pompage protonique reconstitué dans les liposomes¹⁴. Ceci a été réalisé par encapsulation d’un colorant fluorescent membrane imperméable sensibles au pH dans la lumière de liposomes, préparé à partir d’e. coli lipides polaires (Figure 1 a). La quantité de protéines a été optimisée pour que la plupart des liposomes figurant non plus aucun ou qu’une seule molécule d’enzyme reconstituée (selon la distribution de Poisson). Les deux substrats du cytochrome bo₃ ont été fournis en ajoutant l’ubiquinone au mélange lipidique qui formaient les liposomes et oxygène (ambiante) en solution. Les liposomes sont ensuite faiblement adsorbés sur une électrode d’or ultra-lisse semi-transparent, recouverte d’un monocouches auto-assemblées de 6-mercaptohexanol. Enfin, l’électrode est monté sur le fond d’une cellule simple spectroélectrochimiques (Figure 1 b). Contrôle électrochimique de l’état redox de quinone piscine permet de déclencher avec souplesse ou de bloquer la réaction enzymatique à tout moment, tandis que le colorant sensibles au pH sert à surveiller les changements de pH à l’intérieur de la lumière des liposomes par suite de la translocation des protons par le enzymes. En utilisant que l’intensité de la fluorescence d’un colorant fluorescent Deuxièmement, liés aux lipides, la taille et le volume des liposomes individuelles peut être déterminée et donc la quantification de l’activité de pompage de protonique enzyme. En utilisant cette technique, nous avons notamment constaté que cytochrome bo₃ molécules sont capables d’entrer dans un état de fuite spontanée qui dissipe rapidement la force motrice de proton. Le but de cet article est d’introduire la technique de mesure unique liposome en détail.