概要

Mesures de Liposome unique pour l’étude des Enzymes membranaires Proton-pompage, à l’aide de l’électrochimie et microscopie fluorescente

Published: February 21, 2019
doi:

概要

Nous présentons ici un protocole afin d’étudier le mécanisme moléculaire de la translocation des protons à travers les membranes lipidiques des liposomes unique, à l’aide du cytochrome bo3 à titre d’exemple. Combinant l’électrochimie et la microscopie de fluorescence, les variations de pH dans la lumière des vésicules unique, contenant un seul ou plusieurs enzymes, peuvent être détectés et analysés individuellement.

Abstract

Enzymes de proton-pompage d’électron transfert chaînes couple rédox de translocation des protons à travers la membrane, création d’une force proton-motrice utilisée pour la production d’ATP. Le caractère amphiphile des protéines membranaires nécessite une attention particulière à leur maniement et reconstitution dans l’environnement lipidique naturel est indispensable lorsque l’on étudie les processus de transport de membrane comme proton translocation. Ici, nous détaillons une méthode qui a été utilisée pour l’étude du mécanisme de proton-pompage des enzymes d’oxydoréduction membranaires, prenant du cytochrome bo3 d’ Escherichia coli par exemple. Une combinaison de microscopie par fluorescence et de l’électrochimie est utilisée pour contrôler l’état redox des quinone piscine et moniteur changements de pH dans la lumière. En raison de la résolution spatiale de la microscopie fluorescente, des centaines de liposomes peuvent être mesurés simultanément, tandis que la teneur enzymatique peut être réduite à une seule enzyme ou le transporteur par liposome. L’analyse respectifs seule enzyme peut révéler des patrons dans la dynamique fonctionnelle d’enzyme qui pourrait sinon être masquée par le comportement de l’ensemble de la population. Nous incluons une description d’un script pour l’analyse d’image automatique.

Introduction

Informations sur les mécanismes enzymatiques et cinétique sont généralement obtenues au niveau d’ensemble ou échelle macroscopique avec population enzyme par milliers à des millions de molécules, où les mesures représentent une moyenne statistique. On sait, toutefois, que des macromolécules complexes telles que les enzymes peuvent démontrer hétérogénéité dans leur comportement et mécanismes moléculaires observés au niveau de l’ensemble ne sont pas nécessairement valables pour chaque molécule. Ces écarts sur l’échelle de la molécule individuelle ont été largement confirmés par des études sur les enzymes unique avec une variété de méthodes émergent pendant les dernières deux décennies1. Notamment, la détection par fluorescence de l’activité enzymatique individuels a été utilisée pour étudier l’hétérogénéité de l’activité d’enzymes,2,3 et découvrez l’effet de mémoire ce qu’on appelle (périodes d’activité d’enzymes élevés ont réussi par des périodes de faible activité et vice versa)4,5.

De nombreuses études seule enzyme exigent que les enzymes sont immobilisées sur la surface ou dans l’espace fixe dans une autre façon de rester suffisamment longtemps dans le champ de vision pour l’observation continue. Encapsulation d’enzyme dans des liposomes a été démontrée pour permettre l’immobilisation d’enzymes tout en empêchant toute incidence négative due la surface enzymes ou protéines interactions6,7. En outre, les liposomes offrent une possibilité unique pour étudier les protéines de la membrane unique dans leur naturelle lipidique bi-couche environnement8,9,10.

Une classe de protéines membranaires, transporteurs, exerce une translocation directionnelle des substances à travers la membrane de la cellule, un comportement qui ne peut être étudiée lorsque les protéines sont reconstituées dans les lipides des bicouches (p. ex., liposomes)11, 12,13. Par exemple, translocation des protons, exposée par plusieurs enzymes des chaînes de transport d’électrons procaryotes et eucaryotes, joue un rôle important dans la respiration cellulaire en créant une force proton-motrice utilisée pour la synthèse d’ATP. Dans ce cas, le proton de l’activité de pompage est couplé au transfert d’électron, bien que les modalités de ce processus souvent demeure insaisissable.

Récemment, nous avons démontré la possibilité de détection par fluorescence couple avec électrochimie pour étudier l’activité des enzymes unique de l’oxydase d’ubiquinol terminal d’ Escherichia coli ( bo3du cytochrome) de pompage protonique reconstitué dans les liposomes14. Ceci a été réalisé par encapsulation d’un colorant fluorescent membrane imperméable sensibles au pH dans la lumière de liposomes, préparé à partir d’e. coli lipides polaires (Figure 1 a). La quantité de protéines a été optimisée pour que la plupart des liposomes figurant non plus aucun ou qu’une seule molécule d’enzyme reconstituée (selon la distribution de Poisson). Les deux substrats du cytochrome bo3 ont été fournis en ajoutant l’ubiquinone au mélange lipidique qui formaient les liposomes et oxygène (ambiante) en solution. Les liposomes sont ensuite faiblement adsorbés sur une électrode d’or ultra-lisse semi-transparent, recouverte d’un monocouches auto-assemblées de 6-mercaptohexanol. Enfin, l’électrode est monté sur le fond d’une cellule simple spectroélectrochimiques (Figure 1 b). Contrôle électrochimique de l’état redox de quinone piscine permet de déclencher avec souplesse ou de bloquer la réaction enzymatique à tout moment, tandis que le colorant sensibles au pH sert à surveiller les changements de pH à l’intérieur de la lumière des liposomes par suite de la translocation des protons par le enzymes. En utilisant que l’intensité de la fluorescence d’un colorant fluorescent Deuxièmement, liés aux lipides, la taille et le volume des liposomes individuelles peut être déterminée et donc la quantification de l’activité de pompage de protonique enzyme. En utilisant cette technique, nous avons notamment constaté que cytochrome bo3 molécules sont capables d’entrer dans un état de fuite spontanée qui dissipe rapidement la force motrice de proton. Le but de cet article est d’introduire la technique de mesure unique liposome en détail.

Protocol

1. préparation d’un mélange de lipides/UQ-10/FDLL NOTE : E. coli lipides utilisés pour la préparation des liposomes devraient être aliquotés et soigneusement mélangé avec l’ubiquinone-10 (substrat de l’enzyme) et longueur d’onde fluorescents dye-labeled lipides (pour la détermination de la taille des liposomes) avant le reconstitution. À l’aide d’une seringue en verre, transférer 200 µL de stock de chloroforme de lipides polaires extrait de …

Representative Results

La qualité de l’or-modified lamelle couvre-objet (l’électrode) avec une SAM de 6MH est vérifiée avant chaque expérience avec spectroscopie d’impédance électrochimique. Figure 2 a montre représentatifs parcelles de Cole-Cole mesurées par spectroscopie d’impédance électrochimique, avant et après que les liposomes sont adsorbés. Si la qualité de SAM suffit, spectroscopie d’impédance doit démontrer un comportement capacitif presque pur, …

Discussion

La méthode décrite est apte à étudier la proton pompage de protéines membranaires respiratoire qui peuvent être reconstituées dans des liposomes et sont en mesure d’échanger des électrons avec la piscine de la quinone. L’activité de pompage de proton peut être contrôlé au niveau de single-enzymatique à l’aide de colorants sensibles au pH (ratiométrique) encapsulés dans le lumen de liposome (Figure 1 a).

La méthode repose sur la capacité de …

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs reconnaissent le BBSRC (BB/P005454/1) pour un soutien financier. NH a été financé par le programme de jeunes chercheurs VILLUM Foundation.

Materials

6-Mercapto-1-hexanol (6MH) Sigma 451088 97%
8-hydroxypyrene-1,3,6-trisulphonic acid (HPTS) BioChemika 56360
Aluminium holder (Electrochemical cell) Custom-made 30x30x7 mm; inner diameter: 26 mm; hole diameter: 15 mm
Auxiliary electrode platinum wire
Chloroform VWR Chemicals 83627
E.coli polar lipids Avanti 100600C 25 mg/mL in chloroform
Epoxy EPO-TEK 301-2FL low fluorescence epoxy
Fiji (ImageJ 1.52d) Required plugins: StackReg and TurboReg (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/)
Filter cube ("ATTO633") Chroma Technology Corporation Ex: 620/60 nm; DM: 660 nm; Em: 700/75 nm
Filter cube ("HPTS1") Chroma Technology Corporation Ex: 470/20 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("HPTS2") Chroma Technology Corporation Ex: 410/300 nm; DM: 500 nm; Em: 535/48 nm
Filter cube ("Texas Red") Chroma Technology Corporation Ex: 560/55 nm; DM: 595 nm; Em: 645/75 nm
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) ThermoFisher Scientific T1395MP TexasRed-DHPC was used in this work (λexc 595 nm; λem 615 nm)
Fluorescent dye-labelled lipids (FDLL) (alternative) ATTO-TEC AD 633-161 ATTO633-DOPE can be used as alternative (λexc 630 nm; λem 651 nm)
Gel filtration column GE Healthcare 28-9893-33 HiLoad 16/600 Superdex 75 pg, for additional protein purification
Glass coverslips VWR International 631-0172 No 1.5
Glass syringe Hamilton 1725 RNR 250 µL
Glass vials Scientific Glass Laboratories Ltd T101/V1 1.75 mL capacity
Gold GoodFellow 99.99%
Gramacidin Sigma G5002
Mercury sulfate reference electrode Radiometer (Hash) E21M012
Microcentrifuge Eppendorf Minispin NL040
Microscope Nikon Eclipse Ti
Microscope Camera Andor Zyla 5.5 sCMOS
Microscope Lamp Nikon Intensilight C-HGFI
NIS-Elements AR 5.0.2 Nikon Microscope acquisition software
n-Octyl β-D-glucopyranoside Melford Laboratories B2007
Nova 1.10 Metrohm Potentiostat control software
Objective Nikon Plan Apo λ 60x/1.4 oil
OriginPro 2017 OriginLab Plotting software
O-ring (Electrochemical cell) Orinoko Inner diameter: 16 mm; cross section: 1.5 mm
Plastic tubes Eppendorf 3810X 1.5 mL
Polystyrene microbeads Bio-RAD 152-3920 Biobeads, 20-50 mesh
Potentiostat Metrohm Autolab PGSTAT 128N
Potentiostat CH Instruments CHI604C
Scripting software Matlab R2017a Required toolboxes: 'Image Processing Toolbox', 'Parallel Computing Toolbox', 'Curve Fitting Toolbox', 'System Identification Toolbox', 'Optimization Toolbox'
Silicon wafers IDB Technologies LTD Si-C2 (N<100>P) Ø 25 mm, 525 um thick
Teflon cell (Electrochemical cell) Custom-made Outer diameter: 26 mm; inner diameter: 13.5 mm
Temple-Stripped Ultra-Flat Gold Surfaces Platypus Technologies AU.1000.SWTSG Alternative ready-to-use ultra-flat gold surfaces (Thickness below 100 nm on demand)
Thin micropipette tips Sarstedt 70.1190.100 or similar gelloader tips 200 µL
Ubiquinone-10 Sigma C-9538
Ultracentrifuge Beckman-Coulter L-80XP with Ti 45 rotor
Ultrasonic bath Fisher Scientific FB15063

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記事を引用
Mazurenko, I., Hatzakis, N. S., Jeuken, L. J. Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy. J. Vis. Exp. (144), e58896, doi:10.3791/58896 (2019).

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