尿道感染小鼠模型产生的单细胞内细菌群落的分离, 用于下游单细胞分析

这里描述的所有动物处理方法都得到了新加坡基因组研究所动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 和新加坡科学、技术和研究机构生物资源中心的批准。 1. 鼠标感染 玻璃毛细血管的制备 点燃明火源 (本森燃烧器或酒精燃烧器)。 用双手紧紧地捏两端, 握住玻璃毛细管, 然后将管的中间均匀加热, 直到玻璃变软。沿其轴线轻轻来回旋转毛细管, 以帮助均匀加热玻璃。 从热源中取出玻璃毛细管, 立即将双手拉开, 同时保持对管两端的抓地力。拉扯的毛细血管的理想的最后长度是3-5 厘米长比未拉扯的毛细血管, 以确保适当的内径分离单个膀胱上皮细胞。注意事项:在一段时间内, 油管仍然非常热, 所以在热安全的表面上放在毛细管一边冷却几分钟, 然后再继续下一步。 检查玻璃毛细管的中间是否变窄 (图 1a), 以及管道内部是否仍然是空心的 (图 1b)。对于中型散货箱的隔离, 可使用200-400μm 的孔尺寸。 用一只手拿起拉毛细管的一端。用另一只手拿着一对钳子, 用它在最窄的地方拿起拉的玻璃毛细管。确保钳子有足够的力量来紧紧地抓着毛细血管, 而不会压碎它。 使用一个快速扭转运动的手举行钳子, 以捕捉拉毛细管在最窄的点, 以创建一个口微移毛细管。请注意:使用手指而不是钳子也是可以接受的, 只要使用足够的保护, 防止玻璃碎片。 重复步骤 1.1.2-1.1.6 至少4倍以上, 以产生足够的备用微移液毛细血管, 并提供一系列直径, 用于 IBC 隔离。如果预计有一个以上的感染组, 为每增加一个感染组准备5个额外的微移液毛细血管。注意事项:不要忘了关闭明火。 将拉拔的毛细血管放入100毫米 Petri 培养皿中, 并将该培养皿暴露在紫外线辐射下 30分钟, 以消毒毛细血管。 紫外线灭菌后, 将培养皿上的盖子更换, 并在室温下将培养皿与毛细血管一起存放。 感染前导管的制备 按照 Hung等8 和 con弗等人的描述, 至少在感染前一天准备治疗导尿管 。 荧光尿致病性大肠杆菌培养的制备 根据既定方案生长选定的荧光表达泌尿源性细菌株。请注意:菌株和荧光体的选择在很大程度上取决于单个实验室中的显微镜和菌株。在本例中, 我们使用了从 UTI89 衍生出的菌株, 这是一种临床分离株, 最初来自复发性膀胱炎患者。这种菌株 slc-638 携带质粒 (Pslc-77), 表达 vsfGFP-9 和卡那霉素耐药性 18。SLC-638 在37°c 的 LB 肉汤中生长, 辅以50μgml 卡那霉素。 流株 slc-638 在 Luria Bertani (LB)-琼脂板上补充50μgml 卡那霉素。在37°c 下隔夜生板。 (可选)在选择菌落之前, 请查看解剖显微镜上的平板, 以确认荧光标记的表达。 使用细菌接种回路, 将所选择的菌落转移到一个125毫升的锥形烧瓶, 以10毫升的 LB 肉汤补充50μgl 卡那霉素。在37°c 下静态培育烧瓶24小时。 从烧瓶中提取10Μl 培养物, 并在 lb 肉汤中稀释 10ml, 并在新鲜的125毫升烧瓶中补充50μgml 卡那霉素 (1:1000 稀释), 从而对该烧瓶中的细菌进行亚培养。在37°c 下静态地培育第二个烧瓶, 再长24小时。 在 5, 000 x g和4°c 下5分钟的细菌培养。 在 OD600 0.5 下分解上清液并在冷 pbs 中重新悬浮细菌颗粒。请注意:虽然不同的培养可能不同, 但通常为1毫升的静态培养, 约为4-5 毫升的 od600 = 0.5 细菌培养。每个菌株所需的细菌接种总量可按如下方式计算: 每个小鼠需要 50μl, 填充针头需要50μl。建议额外增加 10-20 (最低 50Μl) 的接种剂, 以考虑注射器中的死体积。 使用剩余的细菌混合物来确定感染滴度, 如 Hung 等人8号报告中所述。请注意:通过将细菌混合物存储在 4°c, 此步骤可能会延迟几个小时。 泌尿道感染的小鼠模型 按照 Hung 等人组织第8条描述的方法对小鼠进行感染, 并在第1.3 节中培养的每株荧光大肠杆菌进行一个实验组。请注意:关于视觉协助, 也见 Con弗等人26。 注意对鼠标或保持架进行细菌接种的时间。 对整个实验组重复感染。请注意:感染导管可用于同一组中的所有小鼠。 重复步骤 1.4.1-1.4.3 计划的每个实验组, 确保为每个组准备一个新的导管和新的润滑剂凝胶。请注意:对于大量动物的实验, 最好将动物分成五组, 并错开感染, 使每个组的感染间隔约30分钟至1小时。这将为以下步骤 (第2节和第3节) 提供足够的时间。 2. 膀胱上皮细胞采集以获得细胞悬浮液 收集和倒置小鼠膀胱 准备三个50毫升锥形管充满45毫升的70% 乙醇, 用于手术设备的消毒。 在2.1.1 步步准备的两个管子里, 放一把剪刀和一把钳子。将两对钳子 (一对优选较窄, 并具有圆形尖端, 用于膀胱倒置) 放入第三管。请注意:第一管中的工具将用于外部区域, 第二管中的工具将用于膀胱采集, 最后一管中的两对钳子将用于膀胱倒置。 在感染后 6小时, 根据该机构建立的 IACUC 协议对受感染的小鼠实施安乐死。请注意:我们的 IACUC 协议要求在小鼠处于麻醉状态 (异氟醚) 时通过宫颈脱位进行安乐死。 将动物平放在背上, 用一个充满70% 乙醇的喷雾瓶对它们的腹部进行消毒。 使用第一根管子的钳子和手术剪刀 (步骤2.1.2 准备), 在尿道开口上方约1厘米处的皮肤上做一个小的横向切口。将切口对角线伸向小鼠上肢, 沿小鼠的整个前部创建一个 v 形切口, 露出腹膜的内容物。确保在此过程中, 剪刀不会穿过鼠标的肠道 (图 2a, b)。 切换到第二组工具 (在步骤2.1.2 中准备)。使用剪刀的刀片或钳子的轴, 轻轻地向下推在老鼠骨盆区域附近的脂肪垫。请注意:这一步使膀胱向外突出, 并确保收获的能见度。 用一对钳子抓住暴露在外的膀胱在先端 (图 2c)。 用钳子牢牢抓膀胱先端, 用手术剪刀将膀胱从动物的其他部位 (割伤尿道和输尿管) 中解救出来。不要释放抱着膀胱的钳子。 从剪刀切换到从第三个锥形管 (从步骤 2.1.2) 的较窄的圆形钳, 将圆形钳的一个轴的尖端插入膀胱的开口, 在上一步中刚刚被切割 (图 2d)。用圆钳的尖端安全地插入膀胱的开口, 释放夹住膀胱先端的一对钳子, 并将其返回到第二个锥形管。 使用第三管的第二对钳子, 轻轻地将膀胱 “由内而外”, 首先将膀胱口的外端从圆形钳上拉开 (图 2d, 箭头 1), 并引导它在另一个尖端。(图 2d, 箭头 2)。请注意:这个动作可以比作从一只脚上摘下一只袜子, 把它拉到另一只脚上。 在倒置过程中, 保持第一对圆钳几乎完全关闭。这提供了足够的运动自由, 以拉膀胱从第一轴的圆形钳, 但也使第二轴的圆形钳更接近第一个, 并允许膀胱很容易转移。这一步的最终结果是, 膀胱最终应该被倒置, 并在第一对钳子的第二轴的尖端 (图 2e)。 使用第二对钳子, 轻轻地将倒置的膀胱从钳子的尖端哄成1毫升的冷 PBS。请注意:(可选)现在是拍摄整个倒置、受感染膀胱的图像的适当时机, 以观察中型散货箱的一般频率和分布 (如果有的话)。 对实验组中的每个膀胱重复步骤 2.1.1-2.1.10 (最多五个动物)。 膀胱上皮细胞刮伤 使用两对干净的钳子, 轻轻刮倒膀胱的外部 (这是内部上皮细胞层)。当刮擦收益和上皮细胞被释放到 PBS 溶液中时, 周围的 PBS 应该会出现云。 (可选)视觉上证实膀胱刮擦使用解剖显微镜将细胞释放到溶液中。图 3A、B)。PBS 应该出现多云肉眼, 和刮伤的个别膀胱上皮细胞可以看到10倍的放大倍率。 对步骤2.1 中的每个收获的膀胱重复步骤 2.2.1-2.2.2。 3. 细胞内细菌群落 (IBC) 隔离: 中型散货箱的口腔移液 请注意:本节所述的所有方法都经过了机构风险评估。口移液具有摄入正在转移的溶液的固有风险。此协议使用的纳米卷在很大程度上减轻了这一风险, 我们建议协议的所有用户注意此处和讨论中列出的预防性和实践说明。 在细胞被刮入 PBS 后, 设置口腔微移液装置 (图 3c)。 将拉玻璃毛细管的较厚的一端 (未拉端) 插入吸气管的橡胶插头 (白色端)。 将1毫升移液器尖端的窄端插入吸气管的另一个开口 (红色) 端, 确保配合紧密。 将2毫升吸气移液器的窄端插入1毫升移液器尖端的开口、宽端, 再次确保紧密配合。请注意:由此产生的设置允许研究人员从吸气移液器的更宽、开口的一端发出移液器口, 从设备另一端的毛细管狭窄端产生温和的吸力。 使用含有新鲜去离子水的100毫米 Petri 培养皿测试最后的口腔微移液装置。在吸气移液器的开口端轻微的吸力 (类似于通过吸管喝饮料) 应增加毛细血管中的液体水平, 但不会导致去离子水溢出到吸气管中。用一只手控制毛细管, 同时用另一只手调整培养皿的位置。请注意:单次 IBC 的吸嘴所需的吸力在研究人员中会有所不同。然而, 建议每个尝试这种技术的研究人员从弱吸力开始, 如果没有液体从毛细血管上流动, 慢慢增加吸力。没有必要有比吸吸管喝更大的力量。如果毛细管在3.1.4 的测试中似乎没有拾取液体, 则有可能是毛细管或吸气管被闭塞, 需要更换。进一步建议所有新的研究人员首先使用消毒水控制口腔移液装置中的吸力。此外, 请注意, 口腔移液装置所占用的体积的控制是通过使用研究人员的舌头。舌头可以很好地调整应用吸力的强度, 也可以起到紧急停止的作用。 在成功地吸收液体后, 通过轻轻吹到吸气移液器的开口端, 测试将液体排出毛细管的能力。确保在排出液体的过程中不会产生气泡, 以防止在第3.5 步中污染中型散货箱。请注意:与吸力一样, 研究人员将 IBC 排出离心管的正压强度在研究人员中也会有所不同。建议新加入本协议的研究人员在实际感染前几天练习步骤3.1。实施口腔微移液的一个建议是, 使用口微移液装置, 练习将少量的灭菌水与几滴食品染料 (用于可见性) 混合。 将刮过的细胞悬浮液置于解剖显微镜下, 并将其识别为大型荧光集料 (图 3a、b)。理想的放大倍率范围为20-40x。将玻璃毛细管的细端浸入新鲜的 PBS 管中, 为 1秒, 通过毛细管作用减少不需要的体积的吸收。 通过显微镜观察, 识别感兴趣的 IBC, 并慢慢地将毛细管的开口端朝向 IBC。使用玻璃毛细管的细端清除每个 IBC 附近的额外细胞, 以防止两个或两个以上细胞的吸入, 或分解较大的细胞集合。 在观察显微镜时, 在口腔微移液装置的远端 (吸气移液器) 上施加非常小的吸力, 引导 IBC 进入玻璃毛细管。 拿起中型散货管后, 将毛细管移动到一个空的 1.5 mL 离心管, 并施加轻微的正压, 将液滴和中型散银排出离心管 (图 3d)。 在进入下一个膀胱之前, 在当前膀胱需要尽可能多的中型散货箱上重复步骤 3.3-3.6。经常更换吸气移液器和毛细血管, 以防止唾液堆积。注意事项:在使用传染性 (或临床) 细菌菌株时, 不断监测毛细血管中的溶液水平。不要让液体的液位从毛细管边缘溢出到吸气管中。如果发生这种情况, 请立即切换到不同的吸气管, 并放弃以前的设置。 对所有收获的囊重复步骤 3.2-3.6, 或直到为实验组收集了足够数量的生物样本。 (可选)重复步骤3.6 和 3.7, 直到所有实验组 (或小鼠) 都被安乐死, 并从每个组中采集了足够的生物样本。