عزل واحد المجتمعات البكتيرية داخل الخلايا التي تم إنشاؤها من نموذج موريني لعدوى المسالك البولية لتحليل خلية واحدة أسفل المجرى
概要
ويصف هذا البروتوكول طريقة بسيطة لعزل الخلايا الظهارية واحد، وإصابة المثانة من طراز مورين من عدوى المسالك البولية.
Abstract
في هذه المقالة، نحن مخطط إجراء المستخدم لعزل فرادى المجتمعات البكتيرية داخل الخلايا من ماوس التي قد أصيبوا بالعدوى تجريبيا في المسالك البولية. يمكن تقسيم البروتوكول إلى ثلاثة أقسام: العدوى، وحصاد الخلايا الظهارية المثانة، والفم ميكروبيبيتينج لعزل الخلايا الظهارية المصابة الفردية. الخلية الظهارية معزولة تحتوي على خلايا جرثومية قادرة على البقاء وتقريبا خالية من تلوث البكتيريا خارج الخلية، مما يجعله مثاليا لتحليل خلية واحدة أسفل المجرى. الوقت المستغرق من بداية الإصابة للحصول على مجتمع البكتيريا داخل الخلايا واحد حوالي 8 ساعات. غير مكلفة لنشر هذا البروتوكول ويستخدم مواد متاحة على نطاق واسع، ونحن نتوقع أنها أيضا يمكن أن تستخدم في نماذج أخرى من العدوى عزل الخلايا المصابة واحدة من الخلائط الخلية حتى لو كانت تلك الخلايا المصابة نادرة. ومع ذلك، نظراً لخطر محتمل في الفم ميكروبيبيتينج، هذا الإجراء لا ينصح للعوامل المعدية جداً.
Introduction
التهابات المسالك البولية (UTIs) واحدة من حالات العدوى البكتيرية الأكثر شيوعاً. من المتوقع أن تجربة واحدة على الأقل عدوى المسالك البولية (UTI) خلال بهم العمر1ما يقدر 40-50 ٪ من النساء. أحد العوامل الرئيسية ل UTI أوروباثوجينيك كولاي (أبيك)، التي تمثل أكثر من 70% من غير معقدة يوتيس2. وعلاوة على ذلك، سوف يكون الربع تقريبا من أولئك الذين لديهم UTI عدوى متكررة، غالباً بسبب نفس السلالة، على الرغم من العلاج بالمضادات الحيوية المناسبة3. ارتفاع عدد حالات UTI يمثل عبئا كبيرا على أنظمة الرعاية الصحية، تكلف أكثر من $ 2 بیلیون في السنة في الولايات المتحدة4. وعلاوة على ذلك، يؤدي استخدام المضادات الحيوية لعلاج يوتيس أيضا إلى ارتفاع معدلات المقاومة للمضادات الحيوية، وهو قلق رئيسيا لصحة العامة5.
ولذلك، وضعت جهدا كبيرا في فهم الآليات التي يصيب أبيك المسالك البولية، فضلا عن قدرته على تسبب التهابات متكررة6،،من78. على وجه الخصوص، قد استخدمت نموذج الفأر من العدوى لدراسة خصائص البكتيريا والمضيفة التي تسهم UTI8. هذا نموذج الفأر قد يعود بالنفع قابلة للتطبيق لسلالات السريرية غير معدلة المعزولة من المرضى البشر. كما أدى هذا النموذج إلى اكتشاف مسارات البكتيرية دروجابل محتملة هامة لإنشاء UTI، مثل النوع 1 الهياكل9 والحديد اقتناء نظم10.
بالمقارنة مع هذه النجاحات في دراسة الأحداث المبكرة في UTI، معرفة الآليات الكامنة وراء UTI المتكررة تزال مفتقدة11. فرضية واحدة هي أن أبيك يتهرب من العلاج بالمضادات الحيوية، ويسبب التهابات متكررة في المثانة عن طريق تشكيل المجتمعات داخل الخلايا البكتيرية (الحاويات) داخل الخلايا الظهارية المثانة. الحاويات قد حددت في نماذج مورين من العدوى وفي البشرية UTI المرضى12،13. ارتبط وجود حاويات السوائب الوسيطة في عينات البول من المرضى UTI الأطفال مع ارتفاع معدلات تكرار14،15. ومع ذلك، عزل حاويات السوائب الوسيطة ودراسة البكتيريا داخلها قد ثبت أن تحديا من الناحية التقنية نظراً لندرة بهم؛ يقدر أن مثانة مورين مصابة عادة فقط لديها 10 100 حاويات السوائب الوسيطة16. وعلاوة على ذلك، تكون الخلايا الظهارية المثانة كبيرة نسبيا (50-120 ميكرومتر)17، مما يجعل من تحدي لنشر الأسفار بمساعدة الخلية الفرز (نظام مراقبة الأصول الميدانية) نظراً لأن نموذجية نظام مراقبة الأصول الميدانية فوهات مصممة مع أقطار 70 ميكرومتر أو 100 ميكرومتر. وبالتالي، غالباً ما تتم إزالة خلايا كبيرة مثل الخلايا الظهارية المثانة عن طريق الترشيح من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية لتجنب انسداد في فلويديكس.
ووصف لدينا مختبر مؤخرا طريقة عامة واقتصادا لعزل الخلايا المصابة نادرة من الخلائط مثل كشط الخلايا الظهارية من المثانة18. لعزل فعال حاويات السوائب الوسيطة، استخدمنا بيبيتينج الفم التقليدية. ميكروبيبيتينج الفم هو أسلوب الذي تم استخدامه منذ وقت طويل ميكرومانيبوليشن من الخلايا المفردة والأجنة لأغراض التحليل المصب19،20،21،،من2223، 24 , 25-بيبيتينج الفم التقليدية كميات سائلة كبيرة (في ملليلتر) كثيرا ما كان السبب المختبرية المتعلقة بالحوادث، والتقنية قد تم منبوذة عن حق بكثير من مجتمع البحث خارج علم الأجنة التقليدي و تطبيقات خلية مفردة. لدينا بروتوكول مستوحاة من الإصدارات خلية واحدة فقط من هذا الأسلوب19،20، التي تخفف من المخاطر بتوفير مخزن كبير (> 2 مل) نقل جوي بين الباحث وعينه مقارنة بحجم السائل (< 1 ميليلتر). يأخذ هذا الأسلوب أيضا ميزة التحكم غرامة هذا الفم ويوفر ميكروبيبيتينج، الذي يترجم إلى وحدة تخزين نهائي منخفضة المحيطة بالحل نقل ودرجة نقاء عالية من الخلايا المعزولة. الأسلوب الذي يستخدم مواد غير مكلفة (< 50 دولار)، وهكذا ينبغي أن يكون ممكناً تنفذ في جميع مختبرات.
ويصف هذا البروتوكول البصرية لدينا تقنية عزل الحاوية، توفير مرجع لمساعدة الباحثين الآخرين تسعى إلى تكرار هذا الأسلوب. الباحث بحاجة للوصول إلى مجهر تشريح الفلورسنت (أو معدات مماثلة) التي يمكن استخدامها لوضع تصور الخلايا الظهارية الفردية والبكتيريا الفلورسنت أثناء التصوير الحي، مع مرحلة تصوير مفتوحة ويمكن الوصول إليها من أجل ميكروبيبيتينج (انظر الجدول للمواد للاطلاع على تفاصيل المجهر المستخدمة، على الرغم من أن نماذج يعادل أداة أخرى يمكن أن تستخدم أيضا). بينما سيركز هذا البروتوكول على الحاويات في نموذج مورين UTI، ينبغي أن تكون أساليب مماثلة تنطبق على عزل الخلايا المصابة من تعليق خلية في نماذج أخرى من العدوى.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح البروتوكول التي وصفناها لعزل للسوائب واحدة من طراز مورين من UTI. يعزل هذا البروتوكول الحاويات التي تحتوي على البكتيريا داخل الخلايا قابلة للحياة، والتي يمكن التحقق منها باستزراع لزيمبابوى. نتائج البروتوكول في البكتيريا داخل الخلايا من الحاويات مع القليل من التلوث بالبكتيريا خارج الخلية، مما يتيح لمزيد من الوصف لكل البكتيريا واستضافة الخلية من الحاويات الوسيطة للسوائب (الشكل 4ج). نحن نبين أيضا أن البكتيريا من الحَوسة واحدة يمكن استخدامها في تطبيقات المصب مثل قبكر (الشكل 4ج)، مما يوحي بأن لدينا تقنية يمكن استخدامها لعملية الحاويات لغيرها من التحليلات المختبرية. عن طريق تجميع البكتيريا تحصد من عدد قليل من 5 حاويات السوائب الوسيطة، كذلك نظهر قدرتنا على القيام بتحليل qRT PCR على ثلاثة جينات البكتيريا، مما يوحي بأن الجيش النيبالي الملكي نوعية جيدة يمكن أن تحصد من البكتيريا في أعمالنا الحاويات المعزولة (الشكل 4د). وتشير البيانات أننا أظهرنا جنبا إلى جنب، إلى أن إجراء تحليل الحمض النووي الريبي على نطاق الجينوم (مثل تسلسل الحمض النووي الريبي) على الحاويات واحد قد يكون من الممكن استخدام هذه التقنية العزلة.
في هذا البروتوكول، ركزنا على هذه النقطة مرة ح 6 لأن ذلك عندما أرقام الحَوسة ذروة في أكياس الفئران 6 أسود بالعدوى عن طريق UTI8927. وعلاوة على ذلك، استخدمنا أيضا نظام ثقافة بكتيرية ثابتة لتعزيز مستوى التعبير الهياكل نوع 1 في UTI89. التعبير عن الهياكل نوع 1 أمر حاسم كولاي إرفاقه وتصيب المثانة الخلايا الظهارية28. بيد أن هذا التعبير هو محكم التنظيم29 ومنبهات البيئية معروفة لتغيير ذلك30. من أجل الحفاظ على النمط الظاهري العدوى متسقة وعدد كاف من الحاويات، نوصي باستخدام ثقافة بكتيرية ثابت ح 2 × 24 (معدلة قليلاً من هونغ et al.8) والنقطة وقت الإصابة ح 6 عند العمل مع سبق اختباره كولاي سلالات مثل NU14 و UTI89،من2829. ومع ذلك، من الممكن أن هذه المتغيرات سوف تحتاج إلى تعديل في سلالات UTI الأخرى أو في غيرها سلالات الفئران للحصول على العدد المثالي للحاويات من كل عدوى.
بينما يستخدم البروتوكول من هونغ et al.8 فقط من الفئران الإناث، كانت البروتوكولات الأخرى المتبعة لوضع عدوى المسالك البولية في الفئران الذكور عنها31. في هذا النموذج، التهاب المثانة في الفئران الذكور أيضا يتبع مسار الحاوية. كما قربه الفئران الذكور والإناث متشابهة في الحجم، فإننا نتوقع أن بروتوكولنا العزلة الحَوسة يمكن أن تستخدم في ذكور الفئران المصابة، وكذلك.
كما يضمن بسيطة نسبيا التكنولوجيا المستخدمة في هذا البروتوكول أن يمكن نشرة في معظم المختبرات. واحدة من الخطوات الرئيسية التي تنطوي عليها في هذا البروتوكول هو سحب الشعيرات الزجاجية لإنشاء ميكروكابيلاريس لتحديد نوع الخلية للفائدة. هذه الخطوة تسمح بالمرونة في أقطار ميكروكابيلاريس التي تم إنشاؤها، وهكذا الأسلوب يمكن أن تمتد إلى أنواع متعددة من الخلايا المستهدفة المختلفة. بيد سبب الاختلاف المتأصل في خلق هذه الشعيرات الدموية، يجب الحرص على التأكد من أن القطر النهائي في مجموعة قابلة للاستخدام. إذا كانت الشعيرات الدموية ضيقة جداً، فشلوا في التقاط خلية الاهتمام، ولكن إذا كانت واسعة جداً، ويمكن تحديد عدة خلايا في محاولة واحدة. وعلاوة على ذلك، استخدام اللهب المكشوف خلال عملية سحب شعري يحمل خطر كامن للحروق والحريق، حيث ينبغي أن تأخذ الرعاية الباحث محاولة إنشاء ميكروكابيلاريس لمنع حدوث مثل هذه الأحداث. للحد من التفاوت، فضلا عن خطر الحرائق المفتوحة شاركوا في صنع هذه الشعيرات الدموية، الباحث يمكن أن تجعل استخدام ميكروبيبيتي التقليدية سحب الجهاز، مثل تلك المستخدمة للتجارب الكهربية (مثل PC-100، مجموعة ناريشيجي). كما تجعل هذه الآلات من الجاذبية أو منصات الروبوتية لسحب الشعيرات الدموية، وأنها يمكن أن تكون مصممة لتلبية احتياجات طراز العدوى. بيد أن مجموعة واسعة من ميكروبيبيتي سحب الآلات المتاحة سوف يعني أن الباحث الفردية سوف تحتاج إلى الذهاب من خلال بعض التجربة والخطأ لتحديد القطر الشعرية النهائية المناسبة للاستخدام مع هذا البروتوكول.
عرض البروتوكول يجعل استخدام البكتيريا معربا عن علامة نيون بصريا تحديد الحاوية. وبالتالي، يقتصر هذا الأسلوب الباحثين القدرة على تعديلها وراثيا للكائن الحي المعدية. على وجه التحديد لابيك، سلالات تشكيل الحَوسة مثل CFT073 و NU14 قد نجحت في تحويل مع الإعراب عن بروتينات فلورية خضراء والبلازميدات32،،من3334؛ ولذلك ينبغي أن تكون هذه قابلة للاستخدام في البروتوكول نفسه. استناداً إلى منطقة المثانة (70 مم2) الماوس35وطول الخلايا الظهارية الفردية (50-120 ميكرومتر)17، وتواتر الحاويات في مثانة واحد16، تقدير متحفظ للإصابة بالحاويات عن 1 في 1,000 الخلايا (أو 0.1%). ويعرض هذا التقدير فائدة بروتوكولنا عزل الخلية لاستهداف الأحداث النادرة. دقة تحديد الخلية من خلال موقعنا البروتوكول ومجموعة واسعة من أقطار الشعرية التي يمكن سحبها تشير إلى أنه يمكن استخدام هذا البروتوكول لعزل البكتيريا داخل الخلايا من نماذج أخرى في المختبر والمجراه في العدوى. وفي الواقع، نحن استخدمت بنجاح هذا الأسلوب لعزل الخلايا الظهارية المصابة المثانة المستزرعة (البيانات لا تظهر).
واحدة من أكثر تحديا من الناحية التقنية خطوات في البروتوكول هو عكس المثانة للكشف عن الخلايا الظهارية لإلغاء. وقد وجدنا أن من الممكن أيضا جعل شق على المثانة تباعد لإلغاء. ومع ذلك الواجب ينبغي الحرص على تقليل الأضرار بالخلايا الظهارية من المثانة خلال عملية قطع أنها مفتوحة؛ ومن الناحية المثالية ينبغي أن تستخدم قطع واحد تباعد فتح المثانة. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي الخفض في برنامج تلفزيوني الباردة، لمنع الفقدان العرضي للخلايا أو أنسجة المثانة أثناء العملية.
الفم بيبيتينج للحاويات في هذا البروتوكول يوفر مزيدا من السيطرة على عملية اختيار الخلية، فضلا عن الحد من الحجم النهائي للحل نقل جنبا إلى جنب مع الخلية. مراقبة غرامة وفصل كبير من حل من الفم الباحثين أيضا تكبير سلامة الباحث، نظراً للكميات المنقولة داخل نانولتر لمجموعة ميكروليتير. على النقيض من ذلك، أن تجربتنا مع ميكروبيبيتي الحديث أنه يميل إلى نقل المزيد من السائل المحيطة والخلايا مع الحَوسة، يحتمل أن تؤدي إلى تلوث بالبكتيريا لومينال خارج الخلية. كما أبلغ لنا الاستنتاج أن الفم بيبيتينج يوفر أداء أعلى على خلية واحدة أخرى أساليب العزل بأخرى مختبرات22،،من2324. وبصرف النظر عن عزل خلية مفردة، بيبيتينج الفم حتى استخدمت في خلية واحدة انهانسر للخلايا العصبية25، مما يدل على زيادة الفائدة والسيطرة الدقيقة التي يمكن تحقيق باحث مدربين مع التقنية. بيد أن السلامة من الأهمية ونقترح التدابير الإضافية المحتملة التي يمكن اتخاذها تبعاً لمسببات الأمراض المستخدمة: (ط) تمديد المخزن المؤقت الجوي بين الباحث والمواد البيولوجية، على سبيل المثال باستخدام يسفط ماصة بحجم أكبر (مثلاً، 5 مل)، أو (الثاني) إضافة عامل تصفية الجسدية مثل القطن والصوف إلى ماصة يسفط بمثابة عقبة إضافية.
وفي الحالات التي يؤدي فيها تقييم لمخاطر إلى الاستنتاج بأن بيبيتينج الفم لا تزال محفوفة بالمخاطر أيضا، يمكن الجمع بين الأجهزة الروبوتية المتاحة تجارياً (مثل تلك المستخدمة في نانوينجيكشنز) مع الأقسام الأخرى من لدينا تقنية لتوفير وسيلة أكثر أماناً عزل الخلايا المصابة من المختلطة السكان. تجدر الإشارة إلى أن تجربتنا مع استخدام ميكرومانيبولاتور روبوتية أظهر انخفاض معدل عزل الحَوسة مقارنة بيبيتينج الفم، كما أن التباين داخل تجريبية كبيرة في حجم الخلية الظهارية المثانة يجعلها صعبة للمستخدم الذراع الروبوتية لتحديد القوة المطلوبة لالتقاط واحدة من الحاويات. ومع ذلك، يبقى خياراً قابلاً للتطبيق، على الرغم من أن تكلفة، لأولئك الذين يعملون مع وكلاء المرض المعدي.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا البحث كان تدعمها “المؤسسة الوطنية للبحوث”، مكتب رئيس الوزراء، سنغافورة، ضمن “مخططها زمالة بحثية جبهة الخلاص الوطني” (جبهة الخلاص الوطني جائزة لا. NRF-RF2010-10)؛ المجلس الوطني للبحوث الطبية سنغافورة التابعة لوزارة الصحة (نمرك-سيرج/1358/2013)؛ وفي معهد الجينوم بسنغافورة (GIS)/وكالة العلوم والتكنولوجيا والبحوث (A * ستار).
Materials
| 1.5ml eppendorf tube | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| 100% ethanol | For Alcohol Burner | ||
| 15 ml conical tube | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| 1ml Tuberculin Syringe | BD Biosciences | 302100 | |
| 3% Bacterial Agar | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| 70% ethanol | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Aesculap anatomic forceps | Braun/Kruuse | BD222R | For initial dissection of mouse (skin, fascia) |
| Alcohol Burner | Wheaton | 237070 | |
| Aspirating pipette | BD Biosciences | 357558 | |
| Aspirator tube | Sigma-Aldrich | A5177 | |
| Bacterial loops | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5424 | Any centrifuge for 1.5ml eppendorf tubes |
| Conical flasks | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Digital camera for microscope | Olympus | DP71 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
| Glass Capillaries | Kimax | 6148K07 | |
| Iris Scissors STR SS 110MM | Braun | BC110R | |
| Isoflurane (Isothesia) | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| Kanamycin Sulfate | Calbiochem | 420311 | For static bacterial culture and OD measurement |
| LB broth (Miller) | Thermo/Gibco | 10855021 | For static bacterial culture and OD measurement |
| Light source unit for microscope | Olympus | LG-PS2 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
| Lubricant | KY | Any similar commercial medical lubricant will suffice | |
| Macro fluorescence microscope | Olympus | MVX10 | For image capture and harvesting of IBCs. Any other fluorescent microscope with a GFP channel will suffice |
| Micropipette + micropipette tips | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| PBS 1x | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Pipette controller + Pipettes | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Polyethylene Tubing | BD Intramedic | 427401 | |
| Precision Glide needle 30G | BD Biosciences | 305107 | Possibly under new catalogue number (305106) |
| Splinter forceps curved | Braun | BD312R | |
| Spray bottle (for ethanol) | For static bacterial culture and OD measurement | ||
| Square cuvettes | Elkay | 127-1010-400 | For static bacterial culture and OD measurement |
| Sterilgard III Advance Safety Cabinet | Baker | SG403 | Any biosafety cabinet with a UV irridiator |
| Sterilin 90mm Standard Petri Dish | Thermo | 101VR20 | Any sterile petri dish |
| Stevens, vascular and tendon scissors, curved, delicate, 110 mm | Braun | OK366R | Recommended for harvesting of bladder |
| Surgical Scissors STR S/B 105MM | Braun | BC320R | |
| Tabletop Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Any refridgerated centrifuge for 15ml conicals |
| WPA C08000 cell density meter | Biowave (Biochrom) | 80-3000-45 | For static bacterial culture and OD measurement |
参考文献
- Barber, A. E., Norton, P. J., Spivak, A. M., Mulvey, M. A. Urinary Tract Infections: Current and Emerging Management Strategies. Clinical Infectious Diseases. 57 (5), 719-724 (2013).
- Flores-Mireles, A. L., Walker, J. N., Caparon, M., Hultgren, S. J. Urinary tract infections: epidemiology, mechanisms of infection and treatment options. Nature Reviews Microbiology. 13, 269-284 (2015).
- Foxman, B. Recurring urinary tract infection: incidence and risk factors. American Journal of Public Health. 80, 331-333 (1990).
- Foxman, B., Barlow, R., D’Arcy, H., Gillespie, B., Sobel, J. D. Urinary tract infection: self-reported incidence and associated costs. Annals of Epidemiology. 10 (8), 509-515 (2000).
- Zowawi, H. M., et al. The emerging threat of multidrug-resistant Gram-negative bacteria in urology. Nature Reviews Urology. 12, 570-584 (2015).
- Silverman, J. A., Schreiber, H. L., Hooton, T. M., Hultgren, S. J. From physiology to pharmacy: developments in the pathogenesis and treatment of recurrent urinary tract infections. Current Urology Reports. 14, 448-456 (2013).
- Sivick, K. E., Mobley, H. L. T. Waging war against uropathogenic Escherichia coli: winning back the urinary tract. Infection and Immunity. 78, 568-585 (2010).
- Hung, C. -. S., Dodson, K. W., Hultgren, S. J. A murine model of urinary tract infection. Nature Protocols. 4, 1230-1243 (2009).
- Cusumano, C. K., et al. Treatment and prevention of urinary tract infection with orally active FimH inhibitors. Science Translational Medicine. , (2011).
- Alteri, C. J., Hagan, E. C., Sivick, K. E., Smith, S. N., Mobley, H. L. T. Mucosal Immunization with Iron Receptor Antigens Protects against Urinary Tract Infection. PLoS Pathogens. , (2009).
- Mysorekar, I. U., Hultgren, S. J. Mechanisms of uropathogenic Escherichia coli persistence and eradication from the urinary tract. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , (2006).
- Hunstad, D. A., Justice, S. S. Intracellular lifestyles and immune evasion strategies of uropathogenic Escherichia coli. Annual Review of Microbiology. 64, 203-221 (2010).
- Rosen, D. A., Hooton, T. M., Stamm, W. E., Humphrey, P. A., Hultgren, S. J. Detection of intracellular bacterial communities in human urinary tract infection. PLoS Medicine. , (2007).
- Robino, L., et al. Detection of intracellular bacterial communities in a child with Escherichia coli recurrent urinary tract infections. Pathogens and Disease. 68 (3), 78-81 (2013).
- Robino, L., et al. Intracellular bacteria in the pathogenesis of Escherichia coli urinary tract infection in children. Clinical Infectious Diseases. 59 (11), 158-164 (2014).
- Schwartz, D. J., Chen, S. L., Hultgren, S. J., Seed, P. C. Population dynamics and niche distribution of uropathogenic Escherichia coli during acute and chronic urinary tract infection. Infection and Immunity. 79, 4250-4259 (2011).
- Keshtkar, A., Keshtkar, A., Lawford, P. Cellular morphological parameters of the human urinary bladder (malignant and normal). International Journal of Experimental Pathology. 88, 185-190 (2007).
- Duraiswamy, S., Chee, J. L. Y., Chen, S., Yang, E., Lees, K., Chen, S. L. Purification of Intracellular Bacterial Communities during Experimental Urinary Tract Infection Reveals an Abundant and Viable Bacterial Reservoir. Infection and Immunity. , (2018).
- Kurimoto, K., Yabuta, Y., Ohinata, Y., Saitou, M. Global single-cell cDNA amplification to provide a template for representative high-density oligonucleotide microarray analysis. Nature Protocols. 2, 739-752 (2007).
- Tang, F., et al. Deterministic and stochastic allele specific gene expression in single mouse blastomeres. PLoS One. , (2011).
- Wells, J. M., Melton, D. A. Early mouse endoderm is patterned by soluble factors from adjacent germ layers. Development. 127, 1563-1572 (2000).
- Guo, H., et al. Profiling DNA methylome landscapes of mammalian cells with single-cell reduced-representation bisulfite sequencing. Nature Protocols. 10 (5), 645-659 (2015).
- Zhao, R., et al. The establishment of clonally derived chicken embryonic fibroblast cell line (CSC) with high transfection efficiency and ability as a feeder cell. Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).
- Tang, F., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nature Protocols. 5 (3), 516-535 (2010).
- Wiegert, J. S., Gee, C. E., Oertner, T. G. Single-Cell Electroporation of Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2017).
- Conover, M. S., Flores-Mireles, A. L., Hibbing, M. E., Dodson, K., Hultgren, S. J. Establishment and Characterization of UTI and CAUTI in a Mouse Model. Journal of Visualized Experiments. (100), 52892 (2015).
- Justice, S. S., et al. Differentiation and developmental pathways of uropathogenic Escherichia coli in urinary tract pathogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (5), 1333-1338 (2004).
- Mulvey, M. A., et al. Induction and Evasion of Host Defenses by Type 1-Piliated Uropathogenic Escherichia coli. Science. 282 (5393), 1494-1497 (1998).
- Zhang, H., Susanto, T. T., Wan, Y., Chen, S. L. Comprehensive mutagenesis of the fimS promoter regulatory switch reveals novel regulation of type 1 pili in uropathogenic Escherichia coli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (15), 4182-4187 (2016).
- Gally, D. L., Bogan, J. A., Eisenstein, B. I., Blomfield, I. C. Environmental regulation of the fim switch controlling type 1 fimbrial phase variation in Escherichia coli K-12: effects of temperature and media. Journal of Bacteriology. 175 (19), 6186-6193 (1993).
- Olson, P. D., Hruska, K. A., Hunstad, D. A. Androgens Enhance Male Urinary Tract Infection Severity in a New Model. Journal of the American Society of Nephrology. 27 (6), 1625-1634 (2016).
- Garofalo, C. K., et al. Escherichia coli from Urine of Female Patients with Urinary Tract Infections Is Competent for Intracellular Bacterial Community Formation. Infection and Immunity. 75 (1), 52-60 (2007).
- Berry, R. E., Klumpp, D. J., Schaeffer, A. J. Urothelial cultures support intracellular bacterial community formation by uropathogenic Escherichia coli. Infection and Immunity. 77 (7), 2762-2772 (2009).
- Holden, N., Totsika, M., Dixon, L., Catherwood, K., Gally, D. L. Regulation of P-fimbrial phase variation frequencies in Escherichia coli CFT073. Infection and Immunity. 75 (7), 3325-3334 (2007).
- Jost, S. P. Postnatal growth of the mouse bladder. Journal of Anatomy. 143, 39-43 (1985).
