애벌레 Zebrafish의 측면 라인 세포의 생체 내 칼슘 이미징
概要
zebrafish 모델 시스템을 포함 한 광학 선명도, 급속 한 외부 개발, 많은 귀중 한 기능을가지고 있으며, 청각과 균형의 분야에 특별 한 중요성의 외부 감각 머리 세포 이다. 이 문서 설명 어떻게 유전자 변형 zebrafish 토토 mechanosensation 머리 세포와 연 접 기능을 시험 하는 데 사용할 수 있습니다.
Abstract
감각 세포는 청각과 균형에 필요한 내가 있는 몸의. 세포는 기계적으로 머리 번들 이라고 꼭대기 돌출을 빗 나가게 하는 감각 자극에 대 한 응답에서 활성화 됩니다. 편향 머리 묶음, 칼슘 등 양이온의 유입에 지도에 mechanotransduction (메트로) 채널을 엽니다. 이 양이온 유입 셀 depolarizes 하 고 basally 머리 셀 presynapse에 있는 전압 문을 단 칼슘 채널을 엽니다. 포유류에서 세포는 뼈, 쌌 다 고 기능 vivo에서 이러한 활동을 평가 하기 위해 도전입니다. 대조적으로, 애벌레 zebrafish 투명 하 고 세포를 포함 하는 외부에 위치한 측면 라인 기관 보유. 이 세포 기능 및 구조적으로 포유류 세포 유사 하 고 기능 vivo에서 평가 될 수 있다. 이 문서 설명 유전자 인코딩된 칼슘 표시기 (GECI)를 활용 하는 기술, GCaMP6s, 칼슘 자극 갖는 측정 하 zebrafish 옆 선 세포에서 신호 한다. GCaMP6s 사용할 수 있습니다, confocal 영상, 함께 꼭대기와 옆 선 세포의 기지에서 vivo에서 칼슘 신호 측정에. 이러한 신호는 두 mechanosensation 및 presynapse 종속 칼슘이 세포 내에서 실시간, 정량 판독을 제공합니다. 이러한 칼슘 신호 또한 세포 감지 하 고 감각 자극을 전달 하는 방법에 관한 중요 한 기능 정보를 제공 합니다. 전반적으로,이 기술은 상대 변경에 대 한 유용한 데이터 생성 칼슘 활동 vivo에서. 그것은 덜 잘 칼슘 변경의 절대 규모의 정량화에 적합 합니다. Vivo에서이 기술은 모션 아티팩트에 과민 하다. 적당 한 양의 연습과 기술은 적절 한 위치, immobilization, 그리고 애벌레의 자극에 대 한 필요 합니다. 궁극적으로, 제대로 실행 될 때이 문서에서 설명 하는 프로토콜에 라이브 동물 내에서 그들의 자연, 완전 통합 된 상태에서 세포의 활동에 대 한 귀중 한 정보를 수집 하는 강력한 방법을 제공 합니다.
Introduction
기능성 칼슘 이미징 많은 활동을 모니터링 하는 데 사용할 수 있는 강력한 도구1동시에 세포 이다. 특히, 유전으로 인코딩된 칼슘 지표 (GECIs)를 사용 하 여 칼슘 이미징 GECIs 특정 세포 유형으로 표현 될 수 있습니다 및 subcellularly2지역화 된 때문에 유리한 것으로 표시 되었습니다. 신경 과학 연구에서 이러한 기능은 만들었습니다 칼슘 이미징 GECIs를 사용 하 여 모두 신경 네트워크에서 활동 패턴을 정의 하 고 개별 시 냅 스3,4칼슘 유입 측정 하는 강력한 방법을. 이러한 기능을 이용 최근 연구 사용 confocal 현미경 검사 법 및 GECIs 감각 머리 세포5컬렉션 내의 subcellular 활동을 모니터링.
머리 세포는 몸의 수생 vetebrates6,7측면-라인 시스템에서 내가 운동과 지역 물에 소리와 vestibular 자극을 감지. 세포 손상이 나 유전자 변이 인간 감각 청각 손실8,9로 알려진 청력 손실의 가장 일반적인 형태로 결과의 대상 많습니다. 따라서, 그것은 치료 하 고 청력 손실을 방지 하는 방법을 이해 하려면 이러한 셀 함수를 이해 하는 중요 한입니다. 제대로 작동 하려면 세포 mechanosensory 머리 번들 및 감지 하 고 자극을 각각 전송 시 냅 스 리본 라는 두 개의 특수 구조를 사용 합니다. 머리 묶음 머리 세포의 정점에 위치 하 고 괜 찮 아 요, 털 같은 돌출 stereocilia (그림 1A)로 알려진의 주로 구성 되어. Vestibular와 옆 선 세포, 각 머리 번들 stereocilia (그림 1A) 위에 확장할 수 있는 단일 긴 kinocilium (셀의 유일 하 고 진정한 cilium), 또한 있다. Mechanosensory 자극 편향 머리 번들, 그리고 편향 “팁-링크 라고” stereocilia10를 상호 연결 하는 관계에 긴장을 둔다. 이 긴장 stereocilia, 칼슘11,12를 포함 하 여 양이온의 꼭대기 유입 결과에 있는 mechanotransduction (메트로) 채널을 엽니다. 이 꼭대기 궁극적으로 depolarizes 머리 세포 활동과 전압 개폐 칼슘 채널 (Cav1.3) 셀의 기지에서 열립니다. Cav1.3 채널 인접 한 시 냅 스 리본, 연 접 구조 tethers 활성 영역에 소포를 찾을 수 있습니다. Cav1.3 채널을 통해 기저 칼슘 유입은 소포 융해, neurotransmission, 및 구심 성 뉴런13,14의 활성화 필요 합니다.
몇 년 동안, 전체 셀 패치 클램핑 등 electrophysiological 기법은 많은 종에서 zebrafish15,,1617, 를 포함 하 여 세포의 기능 특성을 사용 되었습니다 18,,1920. 이상의 매우 빠른 자극을 부호화 하는 개별 감각 세포에서 매우 민감한 측정을 얻기 위해 사용할 수 있기 때문에 이러한 electrophysiological 녹음 청각과 균형 분야에서 특히 귀중 한 있다는 주파수 및 강렬21,22의 넓은 범위. 불행 하 게도, 전체 셀 녹음 세포의 활동을 측정할 수 없습니다. Zebrafish 옆 라인에 세포의 활동을 공부, microphonic 잠재력과 성의 활동 전위 사용 된 총계 mechanosensitive 및 개별 neuromasts23의 postsynaptic 응답 속성을 측정 하 ,24. 불행히도, 전체 셀 녹음도 로컬 필드 가능성 측정 활동 개별 셀 내에서 발생 또는 인구 내의 각 세포의 활동을 측정 정확 하 게 공간 해상도. 더 최근에, 칼슘 염료와 GECIs 이러한 과제25,26을 무시 하도록 고용 되었다.
Zebrafish에서 GECIs 만드는 애벌레27의 광학 선명도 유전자 변형 zebrafish의 상대적 용이성으로 인해 머리 세포 기능을 검사 하는 강력한 접근 방식을 입증 했습니다. Zebrafish 애벌레에서 세포는 옆 라인 시스템으로 내가 존재 한다. 측면 라인은 물 운동 (그림 1)에서 로컬 변경 내용을 검색 하는 데 사용 되는 neuromasts 라는 세포의 장미 같은 클러스터 구성 되어 있습니다. 측면 라인은 물고기의 표면을 따라 외부 위치 때문에 특히 유용 합니다. 이 액세스는 세포를 자극 하 여 칼슘 신호 그대로 애벌레에 광학 측정 가능 했다. 전반적으로, transgenesis, 애벌레의 투명도 옆 선 세포의 탁월한 액세스의 용이성이 만들었습니다 zebrafish vivo에서 세포의 활동을 연구 하는 귀중 한 모델을. 이것은 세포 내가 뼈 구조에 의해 포위 된다 포유류 시스템에 비해 상당한 이점을 이다. 접근의이 부족 포유류 세포의 기능 vivo에서 측정을 취득 하기 아주 곤란 했다.
여기에 설명 된 프로토콜 메트로 애벌레 zebrafish에 neuromasts 내에서 셀 간에 개별 세포 내 칼슘 채널 및 presynapse 종속 변화를 모니터링 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜 머리 세포 특정 myosin6b 발기인28의 통제 막 지역화 GCaMP6s을 표현 하는 설립된 유전자 변형 제 브라 라인을 활용 합니다. 이 막 지역화 위치 머리 세포 기능에 대 한 중요 한 원형질 막에 있는 이온 채널을 통해 칼슘 유입 검색 GCaMP6s. 예를 들어 막 지역화 GCaMP6s 칼슘을 감지할 수 메트로 통해 유입 채널 꼭대기 머리 번들 및 CaV통해 셀의 기지에서 시 냅 스 리본 근처 1.3 채널. 이 cytosolic GECIs 메트로 CaV1.3 채널 활동 뿐만 아니라 다른 소스 로부터 칼슘 기부금의 조합 칼슘 신호 감지 GECIs cytosol, 지역화를 사용 하 여 대조 (예:, 저장소 해제). 이 프로토콜 무력화 이미징 이전 GCaMP6s 유전자 변형 애벌레 마비 하는 방법을 설명 합니다. 다음 준비 하 고 액체 제트를 사용 하 여 제어 되 고 재현 가능한 방식으로 옆 선 세포를 자극 하는 머리 번들을 빗 나가게 하는 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜을 사용 하 여 얻을 수 있는 대표적인 데이터 표시 됩니다. 운동 아티팩트를 나타내는 데이터의 예제도 제공 됩니다. 제어 실험 결과 확인 하 고 유물을 제외 하는 데 사용 되는 설명 합니다. 마지막으로, 피지 소프트웨어에서 공간 칼슘 신호를 시각화 하는 방법을 설명 합니다. 이 피지 분석은 이전 설립된 시각화 방법을 MATLAB5를 사용 하 여 개발에서 적응. 전반적으로,이 프로토콜 애벌레 zebrafish 측정 하 고 시각화 vivo에서 머리 세포 칼슘 역학 GECIs를 사용 하 여 강력한 준비 기술을 설명 합니다.
Protocol
모든 동물 작업 동물 사용 위원회 동물 연구 프로토콜 #1362-13에서 건강의 국가 학회에 의해 승인 되었다. 참고:이 프로토콜은 약 0.5 ~ 1 h 솔루션 및 장비는 준비 하 고 사전에 설정 하는 경우 조작 없이 완료를 합니다. 이 프로토콜 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)5,29 zebrafish 애벌레 3-7 일 후 수정 (dpf)에 최적화 되어 있습니다. 막 화 된 GCaMP6s을 표현 하는이 유전자 변형 라인 (zebrafish 코 돈 최적화) 모든 zebrafish 세포에 특히. 이미징, 전에 애벌레는 표준 조건 하에서 배아 버퍼 (E3)에서 발생 합니다. 모든 장비와 약물이이 프로토콜을 실행 하는 데 필요한 카탈로그 번호에 대 한 테이블의 자료 를 참조 하십시오. 1입니다. 솔루션의 준비 Α-bungarotoxin (125 µ M), 기능적인 화상 진 찰 동안 zebrafish 애벌레 마비 하는 데 사용 되는의 1 mL를 준비 합니다. 1 밀리 그램 α-bungarotoxin (전체 병)의 불 임 초순의 968.6 µ L 및 페 놀 레드의 33.4 µ L를 추가 합니다. -20 ° c.에서 그들을 저장 고 100 µ L aliquots주의: 장갑을 착용 하 고 준비는 후드에 α-bungarotoxin 분말을 처리할 때. 장갑은 또한 α-bungarotoxin 솔루션을 처리 하는 경우 권장 됩니다. 60 x 배아 버퍼 (E3) 1 리터를 준비 합니다. NaCl, KCl 분말의 0.76 g 17.2 g 초순 954.4 mL를 추가 합니다. 1 M CaCl2의 19.8 mL, 19.8 mL의 1 M MgSO4, 및 6 mL의 1 M HEPES 버퍼 솔루션에 추가 합니다. 최대 6 개월까지 4 ° C에서 60 x E3 재고 솔루션을 저장 합니다. 준비 1의 10 L x E3 (5mm NaCl 0.17 m m KCl; 0.33 m m CaCl2; 0.33 m m MgSO4, pH 7.2), 애벌레는 기능적 영상 이전에 전파 되는 솔루션입니다. 1 x E3 솔루션 초순의 10 l 60 x E3 재고 솔루션의 167 mL를 추가 합니다. 최대 6 개월 동안 상 온 (RT) 1 x E3 솔루션을 저장 합니다. 신경 버퍼 (NB) (140 mM NaCl; 2mm KCl; 2mm CaCl2; 1 m m MgCl2; 10 mM HEPES 버퍼, pH 7.3), 기능적인 화상 진 찰 동안 애벌레를 몰두 하는 데 사용 되는 준비.참고: 1 x E3 사용할 수 있습니다 또한 기능적인 화상 진 찰, 하지만 응답은 더 강력 하 고 신뢰할 수 있는 NB.에 5 M NaCl의 28 mL, 1 M KCl의 2 mL, 1 M CaCl2, 1의 1 mL의 2 개 mL를 결합 하 여 M MgCl2, 그리고 초순의 957 mL와 10 mL 1 M HEPES 버퍼의. PH 7.3 1 M NaOH와가지고. 필터는 소독. 최대 1 개월 4 ° C에서 저장 합니다.참고: 가져올 RT 솔루션을 사용 하기 전에. MS-222 주식 (tricaine, 0.4%), 애벌레를 anesthetize 하는 데 사용 되는 준비. 400mg 에틸 3 aminobenzoate methanesulfonate 소금 및 100 mL의 증류수에 나2HPO4 의 800 밀리 그램을 디졸브. 7 산도 조정 합니다. 4 ° c.에 게 0.04%를 사용 하 여 MS-222 애벌레 immobilization와 α-bungarotoxin 주입 동안에 anesthetize에. 2입니다. 약 실 및 핀 이미징의 준비 (그림 2A) 이미징 챔버를 준비 합니다. coverslip 준수 합니다 광장의 가장자리를 따라 관류 챔버의 바닥에 높은 진공 실리콘 그리스의 얇은 레이어를 적용. 그리스에 간격을 두지 마십시오. 단단히 눌러는 coverslip의 가장자리 주위 이미징 약 실에 그것을 봉인. 닦 고 멀리 초과 기름.참고: 200 µ L micropipette 팁 5 mL 주사기 그리스 응용 프로그램에 대 한 것이 좋습니다. 챔버를 채우기 위해 실리콘 모듈을 준비 합니다. 경화제에 자료의 (무게)에 의해 10:1 비율로 섞는다. 믹스 철저 하 게 하지만, 부드럽게 micropipette 팁을 사용 하 여 최소한의 거품을 만들 수 있습니다. 있도록 챔버의 표면 수준에 부착된 coverslip 실리콘 모듈을 붓는 다. 약 3g 모듈의 챔버를 채울 것입니다. 신중 하 게 그것을 수평으로 유지 하면서 평평한 표면에 대 한 챔버를 탭 하거나 micropipette 팁 (stereomicroscope) 아래를 사용 하 여 제거 하거나 챔버의 가장자리에 거품을 당겨. 60-70 ° c.에 하룻밤 실험실 오븐에서 챔버를 배치 뜨거운 공기 잔물결을 만들지 않도록 하려면 모듈에 직접 부 하지은 되도록 통풍이 상자 내부 챔버를 놓습니다. 강화 된 모듈에 머리와 꼬리 (그림 2B1) 통해 애벌레를 무력화 하는 데 사용 하는 핀 패션을 잘 집게 및 텅스텐 와이어를 사용 합니다. 머리 핀을 하는 stereomicroscope에서 한 손에 0.035 m m 텅스텐 철사의 조각 잡아. 미세 집게를 사용 하 여 다른 손에서 90도 끝에서 와이어 1 m m까지를 구 부. 좋은 위 대 한 집게를 교환 하 고 핀을 만들 벤드 후 1mm를 잘라. 2.3.1 꼬리 핀, 하지만 굽이의 양쪽에 철사의 0.5 m m를 두고는 0.025 m m 와이어를 사용 하 여 단계를 반복 합니다. 집게를 사용 하 여 (저장용) 상공에 강화 된 모듈에 핀을 삽입. 3. 바늘 마비 및 자극에 대 한 준비 필 라 멘 트와 함께 유리 모 세관을 사용 하 여 심장 주입 바늘을 준비 합니다. 1-3 µ m (그림 2C)의 내부 팁 직경 바늘을 당겨. 사용 하는 필 라 멘 트 없이 유리 모 세관 액체 제트 바늘을 준비 합니다. 얇고, 긴 팁 올바른 팁 직경에 깨진 수 있는 바늘을 당겨. 다른 액체 제트 바늘 또는 바늘 팁 30-50 µ m의 내부 팁 직경 만들려고 구부려 질 수 있다 어디 위에 세라믹에 대 한 수직으로 문 지르고 하 여 액체 제트 바늘의 얇은, 긴 팁 끊다 [그림 2C (중간 이미지)와 그림 3 A 2]입니다. 휴식과 팁 (그림 2C, 중간 이미지) 심지어는 하지 고르지 또는 너무 큰 (그림 2C, 오른쪽 이미지) 보장 하도 고 머리 세포 자극 하는 동안 정확한 유체 흐름 확인 하십시오.참고: 바늘 폴 리 셔는 들쭉날쭉한 나누기를 해결 하기 위해 사용할 수 있습니다. 4. 고정 및 이미징 챔버에 유 충을 Immobilizing 목욕 E3 버퍼 0.04%를 포함 약 1 mL에 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) 유 충 유 충 움직이지 또는 터치 응답 될 때까지 이미징 챔버의 실리콘 모듈 표면에 1-2 분에 대 한 MS-222. 그래서 실리콘 모듈에 대 한 그것의 측면에 평평 거짓말 한 stereomicroscope에서 관류 챔버의 중앙에 유 충을 놓습니다.참고: 일관성을 위해 항상 같은 측면 (예를 들어, 오른쪽 아래, 왼쪽 위로)에 애벌레를 탑재 (그림 2B1). 유 충과 챔버에 수직 아래로 0.035 m m 머리 핀을가지고 미세 집게를 사용 하 여. 눈과 otic 소포 사이 머리 핀을 삽입 (그림 2B1 및 2B2) 모듈에 아래로. 집게의 두 번째 세트를 사용 하 여 고정 하는 동안 그것의 등 이나 복 부 측에 따라서 유 충을 안정. 핀의 수평 부분 연결 하는 유 충 확인 하는 모듈의 모든 방법으로 누르지 않습니다. Ventrally 핀 각도 (그림 2B1)를 가리키는 약간 후속 심장 주입 및 머리 세포 이미징 방해를 피하기 위해 물고기의 앞쪽 또는. (그림 2b 1) 꼬리의 끝에 최대한 가까이 notochord에 0.025 m m 꼬리 핀을 삽입 하는 집게를 사용 하 여.참고: 유 충을 스트레칭 하지 않도록 주의 해야 합니다. 핀 플랫 유 충입니다. 눈 해야 합니다 (그림 2B1)을 겹쳐. 이것은 심장 주입의 용이성을 위해 아주 중요 하다 (그림 2b 2-b 2 ‘, 5 단계), 바람직한 영상 평면을 촉진 (그림 1B1-b 2 ‘, 단계 8, 9), 액체 제트 자극 ( 의 강도 측정 하 고 그림 3A3, 7 단계). 5. 유 충을 마비 심장 구멍으로 α-Bungarotoxin의 주입 참고: Α-bungarotoxin를 처리 하는 경우 장갑을 착용 한다. Α-bungarotoxin 약 수 심장 주입 바늘의 막힘을 방지 하기 위해 사용 하기 전에 간단히 원심 피 펫 팁을 로드 하는 젤을 사용 하 여 심장 주입 바늘으로 α bungarotoxin 솔루션의 백필 3 µ L. 끝 없는 거품을 균등 하 게 솔루션을 로드 합니다. 피 펫 소유자 수동 micromanipulator에 연결에 심장 주사 바늘을 삽입 합니다. Stereomicroscope에서 그래서 ~ 30 °의 각도로 아래로 가리키는 고정 및 마 취 애벌레의 A P 축에 수직으로 정렬 된 바늘을 놓습니다. 압력 인젝터를 피펫으로 홀더를 연결 합니다. 다음과 같은 권장된 설정을 적용: Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0.5 s, 및 Pcompensation = 5 hPa. 바늘 팁 특허 인지 테스트 솔루션으로는 bolus 주사. 바늘의 팁을 (페 놀 레드)에서 빨간 솔루션의 작은 퍼프를 찾습니다. 없는 붉은 색 볼 경우 매우 부드럽게 핀의 가장자리에 바늘 팁을 다쳤어요 하 고 바늘 특허 될 때까지 다시 시도. 또는, 큰 팁 열기와 함께 바늘을 당겨. 심장 (그림 2b 2) 외부 피부 접촉 될 때까지 심장 쪽으로 바늘을 사전. 유 충으로 바늘을 누르고 바늘 유 충을 기준으로 올바른 평면에 배치 되도록 심장 앞 피부에 색소 셀의 들여쓰기에 대 한 보고 (그림 2b 2 ‘). 때까지 피부 pierces 심장 구멍을 입력 더 바늘을 사전. 다시 약간 바늘 당겨. 심장 구멍으로 α-bungarotoxin의 bolus 주사. 붉은 염료 구멍을 입력 또는 심장 구멍의 인플레이션에 대 한 보세요. 부드럽게 씻어 잔류 MS-222를 제거 하는 NB의 1 mL와 함께 3 번 유 충. 결코 모두 액체의 제거. 관류 챔버에 NB의 약 1 mL에 있는 애벌레를 유지 합니다.참고: 그 애벌레 심장 박동 확인 후 고정 하 고 심장 주입 및 전체 이미징 실험을 통해 혈 남아 강력한. 6. 현미경 및 액체 제트 설치 준비 테이블의 자료에 설명 된 구성 요소를 사용 하 여 직 립 confocal 현미경을 조립:는 488 confocal 현미경 nm 레이저 및 적절 한 필터, 제어 하 고 조정 이미징 및 자극, 10 x 어 현미경 소프트웨어 목표, 60 x 물 목표, 압 전-Z (z-스택)에 대 한 객관적인 스캐너, 고속 카메라, 원형 챔버 어댑터, 자동화 한 단계, 및 단계 삽입 어댑터 장 외29 추가 옵션 및 현미경 설정에 대 한 지침을 참조 하십시오. 3 주요 구성 요소로 구성 하는 액체 제트를 조립: 진공 및 압력 펌프, 고속 압력 클램프와 머리 단계 (또한 자료의 테이블에서 설명). 고속 압력 클램프를 사용 하 여 타이밍 및 압력 또는 진공 방전 머리 단계 그리고 액체 제트 피 펫으로의 기간을 제어. 두꺼운 실리콘 튜브를 통해 액체 제트 피 펫 홀더를 머리 무대의 출력을 연결 합니다. 7. 애벌레와 액체 제트의 맞춤 참고: 각 neuromast 내 관심의 3 비행기가 있다: (1) 머리 뭉치의 팁 (그림 3A3: kinocilia, 자극 강도 측정 하는 데 사용); (2) 머리 번들 메트로 비행기 (그림 1B1-b 1 ‘: 메트로 채널 종속 칼슘 신호 감지는 꼭대기 머리 번들의); (3) 시 냅 스 비행기 (그림 1b 2-b 2 ‘: 연 접 칼슘 신호 머리 셀의 기지에서 발견 됩니다). 이 비행기는 그림 1에 설명 되어 있습니다. (3.2 단계)에서 제대로 깨진된 액체 제트 바늘에 NB의 백필 10 µ L 로드 팁 젤을 사용 하 여. 끝 없는 거품을 균등 하 게 솔루션을 로드 합니다. 동력된 micromanipulator에 연결 된 피 펫 소유자에 바늘을 삽입 합니다. 현미경 단계에 원형 챔버 어댑터에 관류 챔버를 놓습니다.참고: 일관성을 위해 항상 같은 방향에서 유 충의 위치 (예: 챔버 유체 제트와 복 부의 후부와 유 충을 포함 하는 실험으로 면). 유 충의 시야의 중심에는 전동된 스테이지를 이동 합니다. 되도록 유 충의 A P 축 약 액체 제트 바늘의 궤적 원형 챔버 어댑터를 설정 합니다. 전송 된 빛과 차동 간섭 콘트라스트 (DIC)을 사용 하, 초점으로 유 충을가지고 하 고 10 배 목표 아래 센터. 10 배 목표를 올립니다. 동력된 micromanipulator를 사용 하 여 내릴 액체 제트 바늘 시야의 센터에 그래서 NB 솔루션 감동 전송 빛과 거의 조명입니다. 낮은 10 배 목표. 그것의 위치를 확인 하는 유 충에 초점. 최대 액체 제트 바늘을 찾는 데 집중 한다. 이동은 micromanipulator와 액체 제트 바늘에는 x 및 y 축 물고기의 등 쪽 측에 평행한 위치에 때까지. 유 충에 다시 집중. Z 축에서 바늘을가지고. 물고기와 몸 (그림 3A1)에서 ~ 1 mm의 등 쪽 측에 따라서 바늘을 위치. 조심 스럽게 이동 원형 챔버 어댑터 (필요한 경우) 액체 제트 바늘 유 충 (그림 3a 1)의 A P 중간에 따라 정렬 됩니다. 보기의 필드의 센터의 neuromast를 전동된 스테이지를 이동 합니다. 물고기의 등 쪽 측에 따라서 액체 제트 바늘 팁을 유지. 유 충 또는 챔버 표면에 액체 제트 바늘의 팁을 만지지 마십시오. 물 목표 x 60으로 전환 합니다. 목적은 NB 솔루션에 몰입은 확인 합니다. 사용 사용 하 여 neuromast를 찾으려고 정밀한 초점 빛과 DIC 광학 전송.참고: 이 설치는 neuromasts 기본 후부 측면 라인을 따라 자극 하도록 설계 되었습니다. 이러한 neuromasts 내의 세포 앞쪽 또는 후부 감독된 유체 흐름에 응답. Neuromast 유체 감도 측면 라인 시스템 내에서 정확한 지도 대 한 추 외.31 을 참조 하십시오. 것 (그림 3a 2) neuromast의 외부 가장자리에서 100 µ m는 micromanipulator와 액체 제트 바늘을 위치.참고: 분명 탑 다운 뷰를 제공 하는 neuromasts를 선택 (수치 1B1’-b 2 ‘ 및 그림 3a 3) 측면 각도 조회 (그림 1C1-C2) 보다. 명확한 하향식 보기 동시 단일 광학 평면에서 모든 꼭대기 머리 번들의 이미징 또는 적은 광학 평면 (그림 3A3)에서 시 냅 스 영역의 이미징 할 수 있습니다. 꼭대기 머리 번들 (kinocilia) (그림 1A, 그림 3A2 3A3)의 끝까지 집중. 액체 제트 바늘의 하단이이 평면에서 초점에 있어야 합니다. 매뉴얼에서 이미징 소프트웨어에서 입력을 받을 수 외부 모드 고속 압력 클램프를 설정 합니다. “0” 버튼을 누르면 고속 압력 클램프를 0. 세트 포인트 손잡이 사용 하 여 약간 긍정적인 휴식 압력 (~ 2 mmHg) 설정. 머리 단계 출력에 연결 된 PSI 압력 계를 사용 하 여 고속 압력 클램프의 휴식 출력을 확인 합니다.참고: 시간이 지나면서 액체 제트 바늘에 액체의 점진적인 이해를 피하기 위해 나머지에서 약간 긍정적인 압력을 설정 합니다. 액체 액체 제트에 연결 하는 튜브를 입력 하는 경우 머리 단계에 도달 하면, 그것은 장비를 손상 수 있습니다. 머리 묶음을 자극 하는 데 필요한 압력을 결정 합니다. 테스트 자극을 적용 하는 0.125, 0.25 V 입력 (6.25와 12.5 mmHg) 200-500 ms를 사용 하 여 (그림 3A3 A3 ‘).참고: 고속 압력 클램프 머리 무대, 그리고 궁극적으로, 액체 제트 바늘에서 방전 되는 압력에 (소프트웨어 또는 BNC 포트 고속 압력 클램프 명령 포트에 연결 하는 다른 장치)에서 입력 전압 변환 (1.0 V = 50 -V 1.0 동안 mmHg =-50 mmHg). 이 구성에서 (단계 7.2 참조) 긍정적인 압력 (푸시) 굴절, 앞쪽으로 머리 번들 및 부정적인 압력 (풀) 굴절 뒷부분으로 머리 번들. 머리카락 뭉치는 kinocilia의 끝의 6.25와 12.5 mmHg 자극에 의해 편향의 거리를 측정 전송된 빛과 규모 바 DIC 광학을 사용 하 여 (그림 1A 와 3A3 3 인물 ‘). 번들 (1 점착 력이 있는 단위)로 이동 하는 압력을 선택 약 5 µ m의 거리 (그림 3A3 ‘). 유지 하는 kinocilia의 팁에 초점 전체 시간. 이동 거리와 kinocilia 5 µ m의 팁 굴절 압력 찾을 수 유 충의 A P 축 액체 제트 ± 25 µ m.참고: 사용 하 여 GCaMP6s 애벌레 3-7 dpf, 5 µ m 편향 GCaMP6s 칼슘 신호 포화 근처 달성 해야과 꼭대기 머리 번들 구조를 손상 하지 한다 (그림 3A3 ‘). 작은 변위 거리 포화 비 자극을 제공 하는 데 사용할 수 있습니다 (그림 3A3’). 변위 거리 > 10 µ m은 견적 하기 단단 하다 ( 그림 3A3 ‘ ‘) 및 시간이 지남에 따라 손상 될 수 있습니다. 채도 신호는 neuromast (및 kinocilial 높이)의 연령에 따른 사용 표시기에 뿐만 아니라. 각 방향으로 (압력/푸시 및 진공/풀) 이미징 동안 주기적으로 액체 제트 바늘의 patency 확인 하십시오. 액체 제트 바늘 쉽게 방해할 진공 patency 잃을 하지만 그들은 잔여 압력 patency 유지. DIC 광학 및 짧은 테스트 자극 각 방향에서 액체 제트 patency 확인을 사용 합니다. 샘플의 (예를 들어, 기본 꼭대기 머리 번들의 또는 머리 세포의 시 냅 스 비행기; 평면에 초점 그림 1 B1-b 2 ‘). 8. 영상 수집 프로시저 옵션 1: 단일 비행기 수집 참고: 이 프로토콜에서 설명 하는 모든 영상에 실시간 수행 10 Hz의 프레임 속도 달성 하기 위해 스트리밍 또는 연속 80 프레임 수집 캡처 모든 100 ms를 얻으려고 이미징 소프트웨어를 설정 합니다. 이득, 조리개, 및 레이저 파워 신호 감지, 최적화 하지만 채도, photobleaching, 및 잡음 방지를 설정 합니다. 예제는 Opterra/SFC에 대 한 설정은 다음과 같습니다: 488 nm 레이저 힘: 50 (머리 번들 메트로 비행기), 75 (시 냅 스 비행기); 35 µ m 슬릿; 이득 = 2.7; 그들 이득 = 3900.참고: 경우 신호 너무 약하거나 시끄러운 또는 과도 한 photobleaching binning X 2를 적용 합니다. 2x binning 지 공간 해상도 비용 신호 검출 향상. 선택 80 프레임 동안 제공 하는 자극 (8 s) 3에서 프레임 30 일 후 수집 s.참고: 몇 가지 예제 자극은 다음과 같습니다: 200 ms (+ 또는-0.25 V) 최대 2 s (+ 또는-0.25 V) 각 머리 세포;의 방향 감도 식별 하기 위해 앞쪽 또는 뒤쪽 방향으로 단계 2 s, 5 Hz의 구형 파 (0.25 V 200 ms, 200 ms-0.25 V 5 번 반복) 모든 머리 자극 세포 동시에. 긍정적인 압력 (앞쪽 자극)는 세포의 절반을 활성화할 것 이다. 부정적인 압력 (후부 자극) 활성화할 것 이다 다른 머리 셀의 절반. 자극 소프트웨어 또는 장치 압력 클램프를 다시 반환 합니다 0 V 자극을 완료 해야 합니다. Mechanosensitive 칼슘 응답을 측정 합니다. 꼭대기 머리 번들의 기지에 초점 (그림 1A 및 1B1-B1’) 이미지 수집을 시작 하 고.참고: 경우는 neuromast는 명확 하 게 위에서 아래 (그림 1B1-b 1 ‘), 모든 꼭대기 머리 번들 단일 평면에서 동시에 이미지 수 있습니다. 연 접 칼슘 응답을 측정 합니다. 머리 세포의 기지에 초점 (그림 1A 및 1B2-b 2 ‘) 이미지 수집을 시작 하 고.참고: 경우는 neuromast 볼 명확 하 게 위에서 아래 (그림 1b 2-b 2 ‘), 모든 세포의 연 접 이미징 비행기 2-3 비행기 세트 2 µ m 떨어져에서 취득 될 수 있다. Tg [myo6b:ribeye-mcherry] 유전자 변형 물고기 식별 하 고 연 접 리본과 칼슘 항목29의 사이트를 찾아 사용할 수 있습니다. 9. 영상 수집 프로시저 옵션 2: 다중 평면 수집 빠른 인수 (12-18 ms)에 대 한 60 x 목표에 부착 된 압 전 Z 조정. 최대 속도 설정 선택 되어 있는지 확인 합니다. 피에 조-Z를 사용 하 여 Z-스택 수집을 만듭니다. 0.5 µ m. 취득 단계 크기 5 비행기에서 머리 번들 메트로 활동 1 µ m 스텝 크기와 5 비행기에 연 접 신호 취득. 10 hz 프레임 속도 설정 합니다. 각 프레임에 있을 것입니다 모든 20 ms와 각 Z-스택 마다 100 밀리초. 8에 대 한 400 프레임 또는 10 Hz에서 80 Z-더미에 대 한 인수를 설정 s 스트리밍 수집. 레이저 파워, 조리개, 및 신호 감지, 최적화 하지만 채도, photobleaching, 및 소음 방지 이득 설정 합니다. 예 Opterra/SFC 시스템에 대 한 설정은 다음과 같습니다: 488 nm 레이저 파워: 75 (머리 번들 메트로 비행기), 125 (시 냅 스 비행기); 35 µ m 슬릿; 이득 = 2.7; 그들 이득 = 3900.참고: 2x binning 신호 너무 약한 경우 적용시끄러운, 또는 과도 한 photobleaching. 2x binning 지 공간 해상도 비용 신호 검출 향상. 프레임 150, 3 후부터 수집 하는 동안 제공 하는 자극을 선택 s. 단일 비행기 수집, 위에 설명 된 대로 프로토콜을 계속 하지만 Z-스택 꼭대기 또는 기저 비행기 (8.4-8.5 단계)에 센터. 10. 제어: 약리 블록 모두 갖는 칼슘 신호 참고: BAPTA (1, 2-bis(o-aminophenoxy) 탄-N, N, n ′, n ′-tetraacetic 산) 치료는이 프로토콜을 처음 설정할 때 중요 한 컨트롤입니다. 8 또는 9 단계를 완료 한 후 주의 5mm BAPTA 쪼개 꼭대기 메트로 채널 머리 번들에 있는 게이트 하는 데 필요한 팁 링크를 포함 하는 NB의 1 mL 바꿉니다. 실시간에 10-20 분 동안 품 어 NB.의 1 mL와 BAPTA 3 번 씻어 8 또는 9 단계를 반복 합니다. BAPTA 치료 후, 꼭대기 머리 번들 또는 시 냅 스 비행기에 액체 제트 자극에 대 한 응답에서 GCaMP6s 형광에 변화가 있어야 합니다. GCaMP6s 형광에 있는 변화 계속 되 면, 이들은 하지 진정한 칼슘 신호 이며 모션 아티팩트를 있을 수 있습니다. 11. 제어: 약리 블록의 연 접 칼슘 신호 (옵션) 8 또는 9 단계를 완료 한 후 주의 머리 셀 presynapse에서 L-타입 칼슘 채널을 차단 하 0.1% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)와 10 µ M isradipine를 포함 하는 NB 바꿉니다. 실시간에서 10 분 동안 품 어 세척 하지 않고, 8 또는 9 단계를 반복 합니다. 치료 후, 아직도 이어야 한다 GCaMP6s 형광 변화 꼭대기 머리-번들만 아니라 시 냅 스 비행기에 액체 제트 자극에 대 한 응답. GCaMP6s 형광에 있는 변화 계속 되 면 시 냅 스 비행기에, 이들은 하지 진정한 칼슘 신호 이며 모션 아티팩트를 있을 수 있습니다. 12. 이미지 데이터의 처리 및 그래픽 표현 참고: 피지 (12.1-12.1.5 단계)와 그래프 프로그램 (12.2-12.2.3 단계)를 사용 하 여 12 단계에 대 한. StackReg, TurboReg (12.1.3 단계), 시간 시리즈 분석 V3 (단계 12.1.4–12.1.6), 그리고 피지 플러그인도 필요 ( 재료의 표참조). 피지, 단일 비행기 시간 시리즈 (80 프레임 단일 평면) 또는 Z-스택 시계열 (400 프레임 멀티 평면)에서 이미지 시퀀스를 엽니다. 클릭 “파일,” 드롭 다운 메뉴에서 “가져오기”를 선택 하 고 클릭 “이미지 시퀀스입니다.” Z-스택 번 시리즈에 대 한 Z-프로젝트 때마다 포인트 (5 비행기 timepoint 당)는 80 프레임 이미지 시퀀스를 만들. 클릭 “이미지,”에 “스택” 드롭 다운 메뉴에서 선택, 드롭 다운 메뉴에서 “도구”를 선택 하 고 “그룹화 Z-프로젝트.” 클릭 투영 방법으로 “평균 강도”를 선택 하 고 “그룹 크기”에 대 한 “5”를 입력 합니다.참고: 추가 공간 정보에 대 한 Z-스택 내의 각 평면을 별도로 분석할 수 있습니다. 8에서 제거 첫 번째 1 s (10 프레임) 이미지 수집의 s (80 프레임). 클릭 “이미지,” 드롭 다운 메뉴에서 “스택” 선택 드롭-다운 메뉴에서 “도구”를 선택 하 고 클릭 “확인 Substack.” “11-80” “슬라이스”를 입력 합니다.참고: 이 substack은 stk1으로 참조 됩니다. 32StackReg 플러그인 사용 하 여 이미지 시퀀스 (stk1)를 등록 합니다. 클릭 “플러그인”에서 “StackReg”를 선택 하 고 70 프레임 시계열에 대 한 등록의 방법으로 “번역”을 선택.참고: 이 등록 된 substack는 stk2로 참조 됩니다. GCaMP6 강도 (F) 측정을 추출 하 번 시리즈 분석기 V3 플러그인을 사용 합니다. 꼭대기 머리 번들 또는 stk2에 연 접 사이트에 관심 (ROI) 영역을 배치 합니다. ImageJ 웹 사이트를 참조 (링크에 대 한 재료의 표 참조) 시간 시리즈 분석기 v 3를 사용 하는 방법에 대 한 지침은.참고: 원형 1-2 µ m ROI를 사용 하 여 꼭대기 머리 번들 및 시 냅 스 평면 (그림 4A1 및 4A2)에 대 한 원형 3-5 µ m 투자 수익에 대 한. 측정 파라미터를 선택 합니다. 클릭 “분석”에 “설정 측정,”를 선택 하 고는 유일한 “” 의미의 회색 값이 선택 되어 있는지 확인. 투자 수익 관리자에서 모든 ROIs를 선택 하 고 여러 측정 함수를 사용 하 여 각 ROI는 시계열에 대 한 (F) 강도 값을 생성 합니다. 투자 수익 관리자 내에서 “더 >>,”를 클릭 하 고 드롭 다운 메뉴에서 “멀티 측정”을 선택 합니다. (F) 값을 플롯 합니다. 붙여 값 (F) “멀티 측정” 결과에서 X-Y 그래프를 만들 수 있는 그래프 프로그램 (그림 4A1 ‘및 4A2’).참고: 만들기 (X) 값을 수동으로 또는 메타 데이터에서 타임 스탬프를 사용 하 여. 사전 자극 프레임 1-20에서에서 그래프 프로그램에서 (F) 값을 평균 하 여 각 ROI에 대 한 초기 계획 (Fo)를 계량. 각 투자 수익에 대 한 (Fo) δ (F Fo) 값을 만드는 각 timepoint에 (F) 값에서 뺍니다. Replot, 원하는 경우 계산 하 고 플롯 δ/Fo. 각 투자 수익에 대 한 분할 (Fo) δ 측정 및 replot (수치 4A1 ‘ 및 4A2 ‘). 13. 이미지 처리 및 Spatio 시간적 칼슘 신호 열 지도 표시 참고: 측면 라인 세포 zebrafish에 공간 열 지도 표현 칼슘 신호를 생성 하기 이전 작업 Matlab5,28에서 작성 된 사용자 지정 소프트웨어를 사용 했습니다. 이 분석은 오픈 소스 분석 소프트웨어 피지33에 대 한 적응 되었습니다. 피지를 사용 하 여 아래 설명 된 모든 단계에 대 한. StackReg 및 TurboReg 피지 플러그인 필요 ( 테이블의 자료참조)도 있습니다. 12.1-12.1.3 stk2으로 등록 된 substack를 만드는 각 Z 스택 또는 단일 평면 시계열에 대 한 단계를 수행 합니다. Stk2 를 사용 하 여 기본 이미지를 만듭니다. 클릭 “이미지,” 드롭 다운 메뉴에서 “스택”을 선택 하 고 “Z 프로젝트”를 선택 합니다. “투영 유형”, “평균 강도”를 선택 하 고 “시작” 조각과 “정지 조각”에 대 한 “20”에 대 한 “1”을 입력 합니다.참고: 이 Z-프로젝션 baselineIMG라고 합니다 것입니다. 일시적으로 14 0.5의 방식으로 70 프레임 (F) 이미지 시퀀스 (stk2) 빈. 클릭 “이미지,” 드롭 다운 메뉴에서 “스택”을 선택, 드롭 다운 메뉴에서 “도구”를 선택 하 고 “Z 프로젝트 그룹화”를 클릭 합니다. “투영 방법,”으로 “평균 강도”를 선택 하 고 “그룹 크기.”에 대 한 5 입력참고:이 그룹화 된 Z-프로젝션 것입니다 라고 하 stk2bin 및 F 그림5. Δ 이미지 시퀀스를 범주화 된 (F) 이미지 시퀀스 (stk2bin)에서 기준선 (baselineIMG)의 픽셀 값을 뺍니다. “프로세스”에 클릭 하 고 드롭 다운 메뉴에서 “이미지 계산기”를 선택 합니다. “Image1″로 stk2bin 및 baselineIMG “Image2” 로 선택 “빼기” “작업”에 대 한 선택참고: 이 기준선을 뺍니다 Z 프로젝션 이라고 stk2binBL 및 F-BL 그림5에서 δ =. Δ 이미지 시퀀스 (stk2binBL)를 표시 하는 선택의 룩 업 테이블 (LUT)을 선택 합니다. 클릭 “이미지,” 드롭 다운 메뉴에서 “조회 테이블”을 선택 하 고 선택의 LUT에 클릭 합니다.참고: “레드 핫” LUT를 그림 5에 사용 되는. 이 기준선을 뺍니다 Z-프로젝션 LUT와 stk2binBL LUT 및 δ LUT 그림 5라고 합니다. 최소 (min)와 최대 (최대) 밝기 값 stk2binBL LUT에 대 한 설정 합니다. 클릭 “이미지,”에서 “조정”을 선택 하 고 “밝기/명암 대비” 클릭. Stk2binBL-LUT에서 배경 잡음을 제거 하려면 최소 값 설정. 관심의 신호를 유지 하지만 신호 포화를 방지 하는 최대 값을 설정 [예를 들어, 200에서 1600 (12-비트 이미지 강도 범위 = 0에서 4095)].참고: 비주얼 비교 또는 표현을 만들 때 동일한 최소 및 최대 값을 사용 합니다. Δ 교정 LUT 바 각 LUT 이미지 시퀀스 (예: stk2binBL LUT)에 대 한 피지에서 생성할 수 있습니다. 클릭 “분석”, “도구”를 선택 하 고 “교정 바”에 클릭. Unclick 참조용 LUT 보정 막대와 별도 개별 이미지를 생성 하려면 “중첩”. Δ (stk2binBL-LUT) 변환원하는 LUTand 일시적으로 범주화 된 (F) 이미지 (stk2bin) RGB 시퀀스. 클릭 “이미지,”에서 “유형,”를 선택 하 고 클릭 “RGB 색.”참고: RGB 변환 Z-예측 것입니다 라고 하 stk2binBL-LUT-RGB 및 stk2bin RGB, 각각. 범주화 된 (F) 이미지 (stk2bin-RGB)에 δ LUT 이미지 (stk2binBL-LUT-RGB)를 오버레이 합니다. “프로세스” 및 다음 “이미지 계산기” 클릭 합니다. Image1 및 Image2로 stk2binBL-LUT-RGB stk2bin-RGB 를 선택 합니다. “작업”에 대 한 “투명 0″을 선택 합니다.참고: 너무 많은 소음이 나 배경 δ LUT 오버레이에 있는 경우에, 단계 min 값을 늘리려면 13.3를 반복 합니다. 채도 있는 경우에, 단계 13.3를 반복 하 고 최대 값을 늘립니다. 14. 이미지 처리 및 Spatio 시간적 열 지도 표현 피지 매크로 사용 하 여 참고: 다음 섹션 13 GCaMP6s 신호 공간 열 지도 표현을 자동으로 만들 수 있는 단계에 따라 LUToverlay 라는 피지 매크로를 참조 합니다. 이 분석에는 오픈 소스 분석 소프트웨어 피지33 ( 재료의 표참조) StackReg 및 TurboReg 피지 플러그인 필요 합니다. 이 프로토콜을 동반 피지 LUT 오버레이 매크로 (LUToverlay.ijm) 다운로드 ( 추가 코딩 파일참조). 다중 평면 시계열 또는 단일 평면 시계열 (단계 12.1 참조)를 엽니다. “플러그인”을 선택 클릭 “매크로” 실행”,” 클릭 하 고 LUToverlay 매크로 선택 합니다. 대화 상자는 텍스트와 함께 “에 대해 말해 당신의 이미지 수집” 표시 됩니다.참고: 대화 상자에 대 한 현재 번호 제안된 값 이며는 실험에서 사용 하는 설정에 따라 변경 될 수 있습니다. 값 상자에 표시 하 고 아래 400 이미지와 timepoint (9 단계) 당 5 비행기 다 비행기 시계열에 대 한 설정 됩니다. “Timepoint 당 비행기의 수” 후 timepoint 당 비행기의 수를 입력 (예를 들어, 단계 12.1.1 여러 비행기를 사용 하 여에 대 한 timepoint, 당 5 비행기와 400 시간 시리즈 “5”를 입력). 단일 평면 수집 (예를 들어, 8 단계) 입력 “1”.참고: 다중 평면 시계열에 대 한 나머지 대화 상자에서 “Timepoints”은 예상 Z 스택에 숫자 이미지 (예를 들어, 단계 12.1.1 이것이 80 timepoints). 첫 번째 1을 제거 하려면 “분석 범위를 정의 하 는” 옵션을 사용 하 여 이미지 시퀀스의 s (예를 들어, 단계 12.1.2 선택에 대 한 “11-80” 처음 10 프레임 및 첫 번째 1 제거 하 s). 초기 이미지를 만드는 데 사용할 이미지의 번호를 입력 후 “timepoints에서에서 정의 기준”, [예: 단계 13.2., “20”을 입력 사전 자극 이미지 (11 월 30 일)을 사용 하 여]. “일시적인 빈 당 Timepoints” 후 오버레이 대 한 빈 이미지의 수를 입력 합니다. (예, 단계 13.2.2. 선택 “5” 14 0.5의 쓰레기통 만드는). 후에 “분 강도”와 “최대 강도” 배경 잡음 (최소)을 제거 하 고 채도 (최대)를 피하고 있는 동안 관심의 신호를 유지 하는 최소 및 최대 밝기 값을 입력 합니다. 오버레이 대 한 원하는 LUT를 선택 후 “조회 테이블”을 선택 합니다. “확인”을 클릭 합니다.참고: 매크로 13 단계에서 제시 하는 지침에 따라 이미지 분석을 완료 합니다. 매크로 의해 생성 된 이미지 또한 13 단계에서 지침에 따라 명명 됩니다. 새로운 이미지 시퀀스를 처리 하기 전에 모든 분석 창을 닫습니다.
Representative Results
Myo6b:GCaMP6s 후-caax 유전자 변형 물고기 제대로 동원 하지 않습니다 액체 제트 자극 측면 라인 세포에 전달 되, 강력한 칼슘 신호와 구상 될 수 있다(그림 4 및 5, binning X 2에서 찍은) 측정. 액체 제트 자극 동안 칼슘 신호 중 메트로 채널 응답 자극, 또는 세포, 어디 연 접 Cav1.3 칼슘 채널 트리거 neurotransmission의 기지에서 열고 꼭대기 머리 묶음에 측정 될 수 있다. 개별 neuromast는 이러한 영역에서 칼슘 응답의 대표적인 예는 그림 4에 표시 됩니다A1 A2 ‘. 이 예에서 2-s 5 Hz 액체 제트 자극 대표 neuromast 내의 모든 세포를 활성화 하기 위해 전달 했다. 자극 하는 동안 강력한 칼슘 신호 머리 번들에서 검출 될 수 있다 (그림 4a 1-a 1 ‘, 8 머리 번들에서 응답 표시 됩니다). 이 시스템에서는, 거의 모든 성숙한 세포 칼슘5의 혀끝이 유입을 표시합니다. 대조적으로, 동일한 neuromast에서 있는 감지 칼슘 신호 기저, 시 냅 스 비행기에 세포의 일부 (~ 30%)만 (그림 4a 2-a 2 ‘, 연 접 응답 4 셀 표시 됩니다)5. 4 아무 중요 한 연 접 칼슘 신호와 ROIs 쇼 셀 그린 (그림 4a 2-a 2 ‘) 강력한 꼭대기 칼슘 신호에도 불구 하 고 (그림 4a 1-a 1 ‘). 이 대표적인 예 (그림 4A1 A2 ‘), 색 ROIs 머리 번들 꼭대기 메트로 평면 (그림 4A1)에서 기저 시 냅 스 평면 (그림 4A2)에서 그들의 셀 시체와 일치. 이 예제에서는 개별 세포 및 세포의 인구 가운데 어떻게 모두 메트로 종속 연 접-칼슘 신호 측정 될 수 있다 강조 한다. 칼슘 신호는 presynapse에서 그리고 두 머리 번들에는 원시 (F) GCaMP6s 강도 또는 δ/Fo GCaMP6s 강도 그래픽으로 그릴 수 있습니다 (단계 12, 참조 수치 4A1’-a 1 ‘ 및 4A2’-A2 ‘). (F) GaMP6s 그래프 강조 각 셀에 대 한 기준선 형광 강도 다를 수 있습니다 (수치 4A1′ 및 4A2’). Δ/Fo GCaMP6s 그래프에서 각 셀의 초기 값을 정규화 하 고 기준선에서 상대 강도 변화 플롯 (수치 4A1 ‘ 및 4A2 ‘). 모두는 (F)에서 δ/Fo GCaMP6s 플롯, 꼭대기 머리 번들 기저 연 접 평면에서 칼슘 신호 자극 (회색 상자)의 개시와 함께 시작 하 고 자극 끝난 후 기 하 급수적으로 감소. 자극, 동안 머리 묶음에 칼슘 신호 빠르게 상승 하 고 편향의 강도 변경 되지 않는 경우 포화 (그림 4a 1-a 1 ‘). 반면, 시 냅 스 평면에서 감지 칼슘 신호와 머리 셀의 하위 집합, 칼슘 신호 보다 점진적 증가 시간과 덜 포화 하는 경향이 있다 (그림 4a 2-a 2 ‘). 세포 연 접 칼슘 신호 (녹색 ROIs) 없이, 칼슘 신호 베이스 라인 근처에 남아 있다. 이러한 그래픽 표현 (그림 4), 이외 칼슘 신호 수 수 시각 공간 전체 neuromast 내 녹음의 시간 과정. Spatiotemporal 표현의 예는 neuromast의 기저 면에 연 접 GCaMP6s 신호에 대 한 그림 5 에 표시 됩니다. 그림 5에서 13 단계에서 설명한 대로 공간 시각화에 대 한 이미지 시퀀스를 처리 하는 단계 설명 되어 있습니다. 첫째, 원시 (F) GCaMP6s 이미지 범주화 일시적으로 [그림 5: 행 1 (14 통 5 표시 됩니다); 단계 13.2.1]. 다음, 사전 자극 프레임 (13.2), 단계에서에서 계산 기준 이미지 δ 이미지를 (F) GCaMP6s 형광 신호에서 뺍니다 (그림 5: 행 2; 단계 13.2.2). 다음, δ 회색조 이미지는 색상 LUT 변환 됩니다 (그림 5: 행 3, 레드 핫 LUT; 단계 13.3). 마지막으로, LUT 변환 δ 이미지는 일시적으로 범주화 된 (F) 이미지 (그림 5, 첫 번째 행)를 자극 하는 동안에 neuromast 내의 spatiotemporal 신호를 공개에 중첩 됩니다 (그림 5: 행 4; 단계 13.4). Δ GCaMP6s 신호 열 지도 제공 모두 귀중 한 공간 및 시간 정보를 단일 ROIs를 그림 4에 사용 된 그래프 밖으로 구문 분석 하는 것은 쉽지 않다. 열 지도 subcellular 정보 개시 및 전체 세포 간의 타이밍 및 강도 차이 뿐만 아니라 각 머리 세포 내의 칼슘 신호의 기간을 포함 하 여 중요 한 spatiotemporal 정보 시각화 수 있습니다. neuromast입니다. 그것은 그래프와 공간 열 지도 진정한 칼슘 신호를 나타내는 고이 때문에 모션 아티팩트를 않습니다 있는지 확인 하는 것이 중요입니다. 이 프로토콜에서 모션 아티팩트 과도 한 드리프트 또는 유 충 또는 액체 제트 자극으로 인해 모션의 움직임의 결과 수 있습니다. 모든 이러한 아티팩트는이 vivo에서 준비를 완전히 제거 하 도전. 이미지 시퀀스 (단계 12.1.3)의 등록에 대 한 해결 하는 수는 z 축에 과도 한 운동으로 x-및 y 축의 이미지 시퀀스에서 움직임의 대부분은 식별 고 분석에서 제거 해야 합니다. 모션 아티팩트는 칼슘 신호 그래프에 의해 식별 하는 가장 쉬운. 유물을 진정한 GCaMP6s 신호는 GCaMP6s 강도 변화의 예는 정점에 관찰 될 수 있다 (그림 4B1’-B1 ‘) 및 기본 (그림 4C1’-c 1 ‘) 세포의. 꼭대기 머리 번들에서 모션 아티팩트는 일반적인 액체 제트 자극이 너무 강한 경우 (그림 3A3 ‘ ‘). 이 지나치게 강한 자극, 동안 꼭대기 머리 번들 비행기 수 액체 제트 자극 동안 초점 이동 돌아갑니다 원래 초점면 자극 종료 후 (그림 4B1’-B ‘). 이것 그것은 어려운 꼭대기 메트로 종속 칼슘 신호를 정확 하 게 측정할 수 있습니다. 머리-번들 모션 아티팩트의 예는 그림 4에서 볼 수 있습니다B1’-B1 ‘. 자, 그래프 자극 (회색 상자) 동안 GCaMP6s 신호 감소를 보여 때 머리 뭉치는 밖으로의 초점. 자극 끝나면 머리 번들 그들의 원래 위치로 반환에 서 다시 초점 GCaMP6s 신호 급속 하 게 증가. 이 그림 4의 예제와 대조A1’-a 1 ‘ 꼭대기 칼슘 신호 자극의 발병 증가 자극 끝날 때 감소. 때문에 과도 한 액체 제트 자극 운동 또한 초점 시 냅 스 비행기 이동, 하는 동안 이러한 유형의 모션 아티팩트가이 비행기에서 보다 적게 일반적 이다. 대신, 운동 또는 드리프트 유 충의 z 축에 초점에 변경 모션 아티팩트의 가장 일반적인 원인이 있습니다. 애벌레 모션 또는 드리프트는 정점 세포의 기지에서 GCaMP6s 측정을 달라질 수 있습니다. 자극 하는 동안 기저, 시 냅 스 비행기에 GCaMP6s 증가 애벌레 모션의 예는 그림 4에 나와C’-C ‘. 모션 아티팩트 (그림 4C1’-c 1 ‘) 진정한 연 접 신호에서 구별 될 수 있다 (그림 4A2’-A2 ‘) GCaMP6s 신호 시간 과정을 검사 하 여. 보다 증가 하 고 자극과 기 하 급수적으로 감소 (그림 4A2’-A2 ‘), GCaMP6s 신호에 모션 유발 증가 사각형 모양 및 상승 그리고 갑자기와 발병 및 자극, (각각의 오프셋 그림 4 C 1 ‘-c 1 ‘). GCaMP6s 신호 시간 과정의 주의 깊은 검사 뿐만 아니라 제어 실험 약리학을 사용 하 여 모션 아티팩트에서 진정한 GCaMP6s 신호를 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다. 예를 들어 BAPTA (10 단계) 다니엘 머리 묶음에 메트로 채널 기능에 필요한 팁 링크에 적용할 수 있습니다. BAPTA Cav1.3 채널을 통해 후속 기저, 연 접 칼슘 유입으로 꼭대기 메트로 채널 종속 칼슘 유입 유체 제트 갖는 모두 제거 한다. 진정한 자극 갖는 칼슘 신호의 대표적인 예 (그림 4A1 A2 ‘) 액체 제트 자극 동안 GCaMP6s 형광 꼭대기와 기초 비행기에 있는 모든 변경 BAPTA 치료 후 제거 될 것 이다. GCaMP6s 형광에 표시 된 같은 모션 때문에 대조적으로, 변경 수치 4B1’-B1 ‘ 및 4 C 1’-c 1 ‘ BAPTA 치료에 의해 제거 되지 것입니다. Isradipine 적용 될 수 있다 BAPTA를 사용 하 여 모든 자극을 불러 일으켰다 GCaMP6s 신호를 제거 하기 위해, 특히 꼭대기 메트로 채널 종속 칼슘 하면서 기저 시 냅 스 평면에서 Cav1.3-종속 칼슘 유입 차단 (단계 11) 유입 그대로5. GCaMP6s 형광 꼭대기 머리 묶음에 있는 아무 모션 아티팩트를 개별 neuromast에서 isradipine의 응용 프로그램 변경 후 (그림 4A1’-a 1 ‘) 액체 제트 자극 하는 동안 것입니다 모든 시 냅 스 GCaMP6s 동안 변경 기지에서 형광 변화를 제거 될 것 이다 (그림 4A2’-A2 ‘). Isradipine 응용 프로그램 후 시 냅 스 평면에서 GCaMP6s 신호에 어떤 변화 (예:,그림 4c 1-c 1 ‘) 모션 아티팩트에 대응할 가능성이 높습니다. 그림 1 : 옆 라인 neuromast와 기능 이미징 비행기의 개요. (A) 왼쪽 다이어그램 4 머리 셀 시체 (블랙) 연락 postsynaptic 구심 신경 (파랑) neuromast의 사이드 뷰를 묘사. 리본 (녹색) 각 셀 내의 연 접 액티브 사이트에서 소포 매 어 놓을. 각 셀 몸 꼭대기 메트로 채널을 포함 하는 stereocilia (1 µ m)의 묶음이입니다. 각 머리 묶음 머리 번들의 기지에 물 모션의 기계적인 힘을 전송 한 kinocilium이 있다. 오른쪽에 다이어그램 하향식 보기에서 동일한 모델을 보여 줍니다. 이 하향식 보기에서 블랙은 왼쪽 다이어그램에 표시 된 4 개의 셀을 나타내는 데 사용 하 고 회색은 neuromast에서 다른 셀을 나타내는 데 사용 됩니다. 이 모델 내에서 이러한 2 플레이, 3 개의 중요 한 비행기 강조 표시 됩니다: (1) 머리 번들 편향, (2) 칼슘 셀을 입력 머리 번들의 기지에서 꼭대기 나 비행기의 크기를 측정 하는 데 사용 하는 머리 번들 (kinocilia)의 끝 자극, 및 (3) 칼슘 시 냅 스 리본 근처 입력 셀의 기지에서 시 냅 스 비행기. (B1-b 1 ‘) Mechanosensation-종속 칼슘 신호를 기록할 수 있습니다 머리 번들의 기지에서 만난 비행기의 DIC와 GCaMP6s 탑-다운 이미지. (B 2-b 2 ‘) B1-b 1으로 동일한 neuromast에서 DIC와 GCaMP6s 하향식 이미지 ‘, 하지만 연 접 칼슘 신호 감지 될 수 있는 시 냅 스 평면에서 neuromast의 기지에서. (C1-C2) GCaMP6s는 애벌레 탑재 잘못 표현 하는 neuromast의 이미지. 이 예제에서는 셀의 기지에서 시 냅 스 비행기 (C2)과 꼭대기 메트로 비행기 (C1) 차선 각도에 배치 됩니다. 이 위치는 모든 머리 번들 단일 평면에서 이미지를 허용 하지 않습니다 그리고 많은 더 이미징 비행기가이 neuromast B1-b 2에 비해 내 모든 시 냅 스에서 활동을 캡처하는 데 필요한 ‘. 5 dpf에 애벌레의 이미지는. C 2에서 눈금 막대 B1 C2의 모든 이미지에 해당합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 2 : 이미징 zebrafish 장착 및 심장 주입 절차, 실과 바늘. (A) 표시는 실리콘 모듈 꼭대기 중앙에 고정 (점선된 사각형에 의해 제시 된) 유 충으로 이미징 챔버. (B1) 표시는 5 dpf 애벌레 움직일 수 두 핀. 큰 머리 핀 그냥 눈에 후부는 신체에 직각에 놓입니다. 두 눈 위 눈 아래쪽 눈에 가려진 완전히 그래서 겹쳐 완전히 있다. 작은 꼬리 핀 꼬리에서 notochord를 교차합니다. 유 충은 평평 하 고 하지 왜곡. (B2) 유 충을 마비, 심장 주입 바늘 시체에 방향된 수직 이며 마음에 인접 한 가져. 심장 주입 바늘 마음 앞 안료 세포를 문의 해야 합니다. (B2’) 피부에 바늘의 우울증 마음 앞 색소 셀의 들여쓰기를 하면 됩니다. (C) 왼쪽에서 오른쪽 순서로 바늘: 약 3 µ m;의 개통을 가진 심장 주입 바늘의 예 약 50 µ m;의 개통을 가진 좋은 액체 제트 바늘의 예 있는 대형 이며 가변 가능성이 생산 과도 하 고 불규칙 한 자극 제대로 깨진된 액체 제트 바늘의 예입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 3 : 액체 제트 정렬, 위치, 및 자극 교정. (A1) 표시 된 오른쪽, 꼬리와 왼쪽 머리 연결 지향 유 충 이며 액체 제트 바늘 지향 zebrafish 본문의 A P 축에 평행 합니다. 이 액체 제트 바늘 앞쪽 (푸시/압력)에 응답 하는 neuromasts 자극을 정렬 하 고 후부 (풀/진공) 지시 유체 흐름. (A2) 패널 및 패널의 오른쪽에 액체 제트 바늘 neuromast (흰색 점선에 의해 제시 된)와 왼쪽에 꼭대기 머리 번들 (kinocilia)의 팁은 표시. 액체 제트는 neuromast의 가장자리에서 위치 대략 100 µ m 이다. (A3 A3 ‘ ‘) 꼭대기 머리 번들 (kinocilia)의 팁 편향된 다른 거리는 액체 제트 자극 압력 변화입니다. 1.5 µ m에 대 한 단일 kinocilial 팁의 궤적 표시 됩니다 (A3’) 및 5 µ m (A3 ‘) 편향 거리. 검은 동그라미는 kinocilium의 휴식 위치를 나타냅니다. 그것은 중요 한 kinocilia는 너무 멀리 빗 나가게 하지, 그렇지 않으면 자극 강도 안정적으로 측정할 수 없는 그리고 손상 될 수 있다 (A3 ‘ ‘). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 4 : 꼭대기 만난 및 측면 선 세포에서 액체 제트 자극 동안 기초 연 접 GCaMP6s 신호. (A1 A2 ‘) GCaMP6s 강도 대표 neuromast 내에서 액체 제트 자극 하는 동안 변경 됩니다. 왼쪽에 이미지 표시 꼭대기 메트로 비행기 (A1)와 같은 neuromast 내 기저 시 냅 스 평면 (A2). A 1과 a 2에 코딩 ROIs 색상 (F)의 시간 과정 및 각 이미지의 오른쪽에 δ/F GCaMP6s 강도 그래프를 그리는 데 사용 되었다. (B1-b 1 ‘) 액체 제트 자극 동안 초과 운동 꼭대기 메트로 이미지 시퀀스의 예입니다. (B1)의 왼쪽에 이미지 ROIs 줄거리 (F)와 오른쪽에 δ/F GCaMP6s 강도 그래프를 사용을 보여 줍니다. (C 1-c 1 ‘) 기저 시 냅 스 평면에서 이미지 시퀀스의 예 쇼 운동 유물과 GCaMP6s 신호 변경 되지 않는 진정한 칼슘 신호. 왼쪽 (C1)에 이미지 ROIs 줄거리 (F)와 δ/F GCaMP6s 강도 그래프 오른쪽에 하는 데 사용을 보여줍니다. 각 그래프에서 회색 상자 각 이미지 시퀀스 동안 액체 제트 자극의 지속 시간을 나타냅니다. 2-s 5 Hz 액체 제트 자극 a 1-a 2에서 예제를 위해 사용 되었다 ‘고 B1-b 1’. C 1-c 1에서 ‘, 2 s 이전 단계 자극 사용 되었다. (F) GCaMP6s 그래프의 Y 축 피지 이미지 강도 측정에서 얻은 임의의 단위 (거리)를 묘사 한다. 모든 예제 4-5 dpf에 애벌레에서 있습니다. 눈금 막대 5 µ m 모든 이미지에 대 한 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 그림 5 : 액체 제트 자극 중의 연 접 GCaMP6s 신호 spatiotemporal 시각화. 자극 하는 동안 GCaMP6s 강도 neuromast 내의 spatiotemporal 변화를 시각화 하는 단계에 설명 되어 있습니다. 시간이는 이미지의 상단에 타임 스탬프에 따라 오른쪽에서 왼쪽 표시 됩니다. 맨 위 행 70 프레임 GCaMP6s (F) 이미지 시퀀스 (단계 13.2.1)에서 14 시간 쓰레기통의 5를 보여줍니다. 두 번째 행에서 기준선 (단계 13.2) δ 이미지 (단계 13.2.2)를 만드는 각 (F) GCaMP6s 범주화 된 이미지에서 제거 되었습니다. 세 번째 행에서 δ 이미지 회색조에서 변환 된 (두 번째 행) 레드 핫 LUT (13.3 단계)를. Min과 max는 이러한 LUT 이미지의 오른쪽 (단계 13.3.1)에 상대 δ 강도 (거리)의 레드 핫 LUT 열 지도 따라 설정 됩니다. 맨 아래 행에 3 행에서 맨 위 행 (단계 13.4) (F) 이미지에 중첩 되었습니다. 그림의 상단에 있는 회색 막대 2-s 5 Hz 액체 제트 자극의 타이밍을 나타냅니다. 예제 5 dpf 애벌레에서 이다입니다. 전설 레드 핫 LUT 열 지도 상대 δ 강도 (거리)의 오른쪽에 표시 됩니다. 눈금 막대 5 µ m 모든 이미지에 대 한 =. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
Vivo에서 화상 진 찰 그대로 동물에 본질적으로 도전 이다. 이 방법에서는 여러 단계는 신뢰할 수 있는 비보에 옆 선 세포에서 칼슘 측정을 얻기에 중요 합니다. 예를 들어 유 충은 고정 하 고 이미징 동안 움직임을 최소화 하기 위해 이미징 하기 전에 제대로 마비 매우 중요 하다. 이미징 동안 초과 운동입니다 진정한 신호 변화 칼슘 수준에 일치 하지 않는 GCaMP6s 형광에서 변화에 지도할 수 있다 (예를 들어, 인물 4B1′-B1 ‘ 및 4 C 1′-c 1 ‘). 꼬리 핀 anteriorly 위해 운동,이 더 많은 후부 neuromasts 액세스할 수 없게 렌더링 수 있습니다 하지만 더 배치할 수 있습니다. 또한, 심장 주입 후 머리 핀 회전할 수 있습니다 있도록 핀의 수평 부분 노 른 자에서 속 인 다. 핀의 위치를 변경 하는 것 이외에 애벌레34무력화를 핀 대신 뇌-슬라이스 하프를 사용 하 여 가능 하다. 위에 놓으면 애벌레 제대로, 하프를 추가, 잠재적으로 immobilizing 애벌레의 침입 방법은 더 적은 이다. 중요 한 운동 부족 고정에서 발생할 수 있습니다, 하는 동안 제대로 수행 α-bungarotoxin를 제공 하 여 애벌레 마비 심장 주입 수 불완전 마비, 운동, 고 궁극적으로 모션 아티팩트. 일반적으로 사용된 마 취약 영향 zebrafish 세포의 흥분을 표시 되었습니다, 하지만 최근 작품 마 취 benzocaine 머리 세포 활동의 여러 측면으로 방해 하지 않는 보이고 있다. 마찬가지로, 더 일반적으로 MS-222만 머리 세포 활동15의 특정 측면을 방해 하는 마 취를 사용. 따라서, α-bungarotoxin 주입의 도전 특성상 benzocaine 또는 MS-222 응용 프로그램 기능 칼슘 이미징 동안 유 충에 움직임을 방지 하기 위해 마비의 유용한 다른 방법으로 증명할 수 있습니다.
이 프로토콜에 관련 된 기술적인 문제 이외에 완벽 하 게 탑재 된 샘플은 유 충 및 세포 이전 및 각 이미징 실험 동안 건강 하지 않은 경우 쓸모 없다. 되도록 애벌레 및 세포 건강, 애벌레 하 chorions (계란 껍질), 폐기물, 미생물 등 파편의 E3 버퍼에 유지 된다 중요 하다. 옆 선 세포의 표면 위치는 영상에 대 한 유리한,이 위치는을 그들 세포 손상에 더 취약 E3 버퍼 반 칙 때. 깨끗 하 고 수성 환경 특히 젊은 애벌레 (2-4 dpf)에 대 한 중요 한 또는 똑바로 수영을 유지할 수 없습니다 돌연변이 놓고 주로 페 트리 접시의 하단에 거짓말. 이러한 상황에서 옆 라인 세포 및 머리 번들을 둘러싼 보호 cupula 손상 수 있습니다 쉽게 될. 건강 한 애벌레와 각 실험의 과정을 통해 세포로 시작 하는 경우에 그것은 유 충에 심장 박동 및 급격 한 혈액의 흐름에 중요 한. 경우 혈 류 속도가 느려집니다 또는 중지, 머리 세포의 건강을 손상 될 수 있습니다. 손상 된 준비는 건강에 해로운 애벌레 또는 혈액 흐름의 손실, 죽어가는 세포 확인 될 수 있다 여러 가지 방법으로: 첫 번째, karyopyknosis 또는 셀 내에 DIC 광학; 아래 거품으로 명단 핵 응축의 모양으로 둘째, 세포 수축과 빠르게 이동 하는 세포질; 내 입자의 존재에 의해 그리고 세 번째 때 kinocilia 팁 다른 방향35에 밖으로 퍼짐. 머리 번들 중단 됩니다 때 자극 동안 splayed kinocilia 노드라고도 함 함께 이동 하지 않습니다.
이 준비는 하나는 준비만 남아 강력한 1-3 시간 후에 설정에 대 한 몇 가지 사소한 제한이 있습니다. 작은 핀 이나 뇌 슬라이스를 사용 하 여 수정 하프 애벌레를 무력화 하 고 관류 시스템 추가이 비보에 준비의 수명을 연장할 수 있습니다. 또 다른 한계는 photobleaching 이며 phototoxicity 이미징 실험을 반복 후 발생할 수 있습니다. 이 문제를 극복 하기 위해 하나의 흥미로운 방법은 빛 시트 현미경 검사 법에 대 한이 프로토콜에 맞게입니다. 빛-시트 현미경 초점 빛, 적은 photobleaching 및 phototoxicity36선도에서 줄일 수 있는 강력한 방법입니다. 함께, gentler immobilization와 적은 사진 노출 각 이미징 세션 연장 도울 수 있다. 더 이상 이미징 세션 검사 기능 변경 개발 및 머리 세포 클리어런스 및 부상 후 재생 기본 프로세스의 전체 기간을 사용할 수 있습니다. 빛 시트 현미경 검사 법, 뿐만 아니라이 프로토콜 적응 시킬 수 있다 다른 종류 confocal 시스템 (포인트 검색, 2-광자, 및 회전 디스크)에 상대적으로 간단한 widefield 시스템28,34 뿐만 아니라 다는 것을 지적 하는 것이 중요 하다 . 전반적으로, 그 다양성에 게 적응 하 고 여러 이미징 시스템에 사용 될 수 있는 유용한 도구를 프로토콜 합니다.
이 프로토콜 적응 수 고 많은 이미징 시스템을 사용 하는 동안이 프로토콜의 부분 또한 적응 고 (1) GCaMP6s 외 고 (2) 다른 감각 세포와 신경 애벌레 zebrafish 내 이미지 활동에 다른 지표와 함께 사용할 수 있습니다. 예를 들어 이전 연구에서 우리는이 프로토콜 cytosolic 칼슘 (RGECO1), 소포 융해 (SypHy), 막 전압 (Bongwoori), 고 막 검출 하 옆 라인 세포 내의 여러 유전자 인코딩된 지표를 사용 하 여 이미지 작업을 사용 칼슘 (jRCaMP1a-caax GCaMP6s caax), 측면 라인 입성 프로세스 감지 막 칼슘 (GCaMP6s-caax)5를 내. 이러한 표시기를 사용 하 여 우리의 경험을 바탕으로,이 프로토콜에서 설명 하는 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) 유전자 변형 라인 옆 라인 neuromasts에 활동을 이미징에 대 한 훌륭한 시작을 제공 합니다. 위에 나열 된 모든 지표, 우리 GCaMP6s은 가장 민감하고 photostable 것으로 나타났습니다. 이러한 기능 이외에 우리 강조 Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) 유전자 변형 라인 두 가지 측정 하는 데 사용 될 수 있습니다 때문에: 머리-셀 mechanosensation 및 단일 유전자 변형 선 내 연 접 칼슘.
이 문서에 설명 된 기술을 어떻게 zebrafish 측면 라인에서 칼슘 이미징 세포 그들의 네이티브 환경에서 작동 하는 방법을 연구 하는 강력한 방법을 수 보여 줍니다. 이 방식은 어떤 머리 셀에 함수 현재 공부 하 고 전 비보 explants에 포유류의 연구를 보완 합니다. 또한, zebrafish 모델 포유류 세포에 활동을 검사에 적용할 수 있는 유전자 인코딩된 지표의 효능 테스트 플랫폼으로 사용할 수 계속 수 있습니다.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH/NIDCD 교내 연구 자금 1ZIADC000085-01 (K.S.K.)에 의해 지원 되었다. 우리는 피지 매크로 작성에 그녀의 원조에 대 한 사탕 웡을 인정 하 고 싶습니다. 우리 또한 도리스 우와 사탕 웡 프로토콜 도움이 그들의 제안에 감사 하 고 싶습니다.
Materials
| Section 1 | |||
| α-Bungarotoxin | R&D Systems | 2133 | For paralyzing larvae prior to imaging |
| Phenol red Solution 0.5% | Sigma-Aldrich | P0290 | For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing larvae |
| Section 2 | |||
| Imaging chamber | Siskiyou | PC-R | Platform to mount larvae for imaging |
| No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm | VWR | 48366-227 | To seal imaging chamber |
| High vacuum silicone grease | Fischer Scientific | 14-635-5D | For affixing of coverslip to imaging chamber |
| Silicone encapsulant clear 0.5 g kit | Ellsworth Adhesives | Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | To fill imaging chamber to create a surface to pin fish |
| Oven | Techne | HB-1D | For drying silicone encapsulant |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating wire, forceps and scissors to make pins |
| Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For making pins |
| Fine scissors | Cole-Palmer | 5.5", EW-10818-00 | For cutting tunsgten wire to make pins |
| Tungsten wire, 0.035 mm | Goodfellow | W005131 | For head pins to immobilize larvae |
| Tungsten wire, 0.025 mm | ThermoFischer Scientific | AA10405-H4 | For tail pins to immobilize larvae |
| Section 3 | |||
| Micropipette guller | Sutter Instrument Company | P-97 | For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles |
| Borosilicate glass capillaries w/ filament | Sutter Instrument Company | BF 150-86-10 | Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection |
| Borosilicate glass capillaries w/o filament | Sutter Instrument Company | B 150-86-10 | Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells |
| Pipette polisher | Narishige | MF-830 microforge | To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks |
| Ceramic tile | Sutter Instrument Company | NC9569052 | For scoring and evening breaking fluid-jet needles |
| Sections 4 & 5 | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For pinning larvae |
| Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling heart injection needles |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating larvae during pinning and heart injection |
| Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
| Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection |
| Pressure injector | Eppendorf | Femtojet 4x | To deliver α-bungarotoxin |
| Sections 6, 7 & 8 | |||
| Confocal microscope | Bruker | Swept field/Opterra confocal microscope | Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters |
| Microscope software | Bruker | Prairieview 5.3 | To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet |
| 10X air objective | Nikon | MRH00101 | Low magnification for positioning of larvae and fluid jet |
| 60X water objective | Nikon | MRF07620 | Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm) |
| Piezo-Z objective scanner with controller/driver | Physik Intruments instruments/Bruker | 01144210/UM-Z-PZ | High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy |
| EMCCD camera | QImaging | Rolera EM-C2 EMCCD camera | Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s |
| Circular chamber adapter | Siskiyou | PC-A | For holding and rotating imaging chamber on microscope stage |
| Motorized Z-deck stage | Prior Scientific | ZDN12MP | Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together |
| Z-deck stage insert adaptor | NIH Machine shop | custom | To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage |
| Fluid-jet apparatus | ALA scientific instruments | HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP | For controlling and delivering the fluid-jet stimulus |
| Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft) | Cole-Palmer | Masterflex L/S 13, 96400-13 | For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Company | MP-225 | For holding and positioning of needle holder for fluid jet |
| Micromanipulator controller | Sutter Instrument Company | MPC-200 | For controlling fluid-jet needle manipulator |
| Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling fluid-jet needles |
| Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
| PSI manometer | Sper Scientific | 840081 | For measuring pressure clamp output |
| Section 9 | |||
| BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant | ThermoFischer Scientific | B1204 | To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals |
| Isradipine | Sigma-Aldrich | I6658 | To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Solvent for pharmacological compounds |
| Section 10 | |||
| Prism7 | Graphpad | Prism7 | Software to plot GCaMP6 intensity changes |
| FIJI | Schindelin, et., al.34 | https://fiji.sc/ | Software to process images and create spatio-temporal signal maps |
| Turboreg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
| StackReg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
| Times Series Analyzer V3 Plugin | Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html | Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes |
参考文献
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Pérez Koldenkova, V., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).
- Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
- Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
- Eatock, R. A. Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives. Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).
- Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development. IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).
- Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
- Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).
- Ricci, A. J., Wu, Y. -. C., Fettiplace, R. The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells. Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).
- Moser, T., Beutner, D. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).
- Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).
- Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish. The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).
- Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish. The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).
- Griguer, C., Fuchs, P. A. Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick. Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).
- Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).
- Goutman, J. D., Pyott, S. J. Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti. Methods in Molecular Biology. 1427, 471-485 (2016).
- Einarsson, R., et al. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
- Fuchs, P. A. Time and intensity coding at the hair cell’s ribbon synapse. The Journal of Physiology. 566, 7-12 (2005).
- Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. Hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Chapter 8 – Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
- Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. Physiological recordings from the zebrafish lateral line. Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).
- Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM. PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Chapter 10 – Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).
- Sheets, L., et al. Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).
- Chou, S. -. W., et al. A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish. Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- . Fiji is just ImageJ Available from: https://fiji.sc/ (2018)
- Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).
- Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 193, 18-29 (2017).
- Fadero, T. C., et al. LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching. Journal of Cell Biology. , (2018).
