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Abstract
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神経科学

En proyección de imagen del calcio Vivo de las células de pelo de la línea Lateral en el pez cebra larvas

Published: November 28, 2018
doi:
10.3791/58794
,
1Section on Sensory Cell Development and Function,NIDCD/National Institutes of Health, 2National Institutes of Health-Johns Hopkins University Graduate Partnerships Program

概要

El pez cebra es un modelo de sistema que tiene muchas características valiosas, incluyendo claridad óptica, desarrollo externo rápido y, de especial importancia para el campo de la audición y el equilibrio, situado externamente células de pelo sensoriales. Este artículo describe cómo transgénico pez cebra puede utilizarse para análisis función presináptica y mechanosensation célula de pelo en su totalidad.

Abstract

Sensorial de las células ciliadas son mecanorreceptores encontradas el oído interno que se requieren para la audición y el equilibrio. Las células ciliadas se activan en respuesta a estímulos sensoriales que mecánicamente se desvíe apicales salientes llamados paquetes del pelo. Desviación abre canales de mecanotransducción (MET) en paquetes del pelo, conduciendo a una afluencia de cationes como el calcio. Esta afluencia de cationes despolarizan la célula y abre canales de calcio voltaje-bloqueado basally situados en la presynapse de la célula de pelo. En los mamíferos, las células de pelo son en hueso, y es un reto para evaluar funcionalmente estas actividades en vivo. Por el contrario, pez cebra larvas son transparente y poseen un órgano de línea lateral situado externamente que contiene células de pelo. Estas células de pelo son funcionalmente y estructuralmente similares a las células mamíferas del pelo y puede ser evaluadas funcionalmente en vivo. Este artículo describe una técnica que utiliza un indicador de calcio genéticamente codificados (GECI), señales de GCaMP6s, para medir calcio evocado por el estímulo en pez cebra células de pelo de la línea lateral. GCaMP6s puede utilizarse, junto con la proyección de imagen confocal, para medir señales de calcio in vivo en el ápice y la base de las células ciliadas de la línea lateral. Estas señales proporcionan una lectura en tiempo real, cuantificable de ambas actividades de calcio dependientes de presynapse y mechanosensation dentro de estas células de pelo. Estas señales de calcio también proporcionan importante información funcional acerca de cómo las células de pelo detectar y transmitir estímulos sensoriales. En general, esta técnica genera datos útiles sobre los cambios relativos en la actividad de calcio en vivo. Es menos adecuado para la cuantificación de la magnitud absoluta de los cambios del calcio. Esta técnica in vivo es sensible a los artefactos de movimiento. Una cantidad razonable de práctica y habilidad se requieren para la colocación apropiada, inmovilización y estimulación de las larvas. En última instancia, cuando se ejecuta correctamente, el protocolo descrito en este artículo proporciona una manera de gran alcance para recopilar información valiosa sobre la actividad de las células de pelo en su estado natural, completamente integrado dentro de un animal vivo.

Introduction

La proyección de imagen funcional del calcio es una poderosa herramienta que puede utilizarse para supervisar la actividad de muchas células simultáneamente1. En particular, la proyección de imagen de calcio utilizando indicadores genético codificados calcio (GECIs) ha demostrado ser ventajosa porque GECIs puede expresarse en tipos celulares específicos y localizados subcellularly2. En la investigación de la neurociencia, estas características han hecho imágenes de calcio utilizando GECIs un poderoso método para definir patrones de actividad dentro de las redes neuronales tanto medir la afluencia del calcio en la sinapsis individuales3,4. Aprovechando estas características, un estudio reciente utiliza la microscopia confocal y GECIs para supervisar actividad subcelular dentro de colecciones de células de pelo sensoriales5.

Las células de pelo son los mecanorreceptores que detectan estímulos de sonido y vestibulares en el oído interno y el movimiento de agua en el sistema de línea lateral en acuáticos vetebrates6,7. Las células de pelo son a menudo objetivo de daños o mutaciones genéticas que resultan en la forma más común de pérdida de audición en los seres humanos conocida como pérdida de oído sensorineural8,9. Por lo tanto, es fundamental para entender cómo estos función de las células con el fin de entender cómo tratar y prevenir la pérdida de la audición. Para funcionar adecuadamente, las células de pelo utilizan dos estructuras especializadas llamados paquetes mechanosensory-pelo y cintas sinápticas para detectar y transmitir estímulos, respectivamente. Paquetes del pelo se encuentran en el ápice de las células ciliadas y se componen principalmente de protuberancias finas, como pelos, conocidas como estereocilios (figura 1A). En las células de pelo vestibulares y de la línea lateral, cada paquete de pelo también tiene una sola kinocilium largo (cilio único y verdadero de la célula), que puede extenderse muy por encima de los estereocilios (figura 1A). Estímulos de Mechanosensory desvían paquetes del pelo, y desviación pone tensión en los vínculos que se llama “punta-links” que interconectan estereocilios10. Esta tensión abre canales de mecanotransducción (MET), situados en los estereocilios, dando por resultado una afluencia apical de cationes como calcio11,12. Esta actividad apical finalmente despolarizan la célula de pelo y abre canales de calcio voltaje-bloqueado (Cav1.3) en la base de la célula. Canales de CAv1.3 se encuentran adyacentes a cintas sinápticas, una estructura presináptica que anclar las vesículas en zonas activas. Afluencia del calcio basal a través de canales de Cav1.3 es necesario para la fusión de la vesícula, la neurotransmisión y la activación de neuronas aferentes13,14.

Durante muchos años, se han utilizado técnicas electrofisiológicas como parche de células completas de sujeción para probar las propiedades funcionales de las células de pelo en muchas especies, incluyendo peces cebra15,16,17, 1819,de,20. Estas grabaciones electrofisiológicas han sido particularmente valiosas en el campo de la audición y el equilibrio porque pueden ser utilizados para obtener mediciones extremadamente sensibles de las células sensoriales individuales, cuyo propósito es codificar estímulos extremadamente rápidos sobre un amplia gama de frecuencias e intensidades de21,22. Por desgracia, grabaciones de celulares no pueden medir la actividad de las poblaciones de células de pelo. Para estudiar la actividad de las poblaciones de células en la línea lateral del pez cebra, potenciales microfónicos de la coclea y los potenciales de acción aferentes se han utilizado para medir las propiedades de la respuesta postsináptica de neuromasts individuales23 y mechanosensitive sumado ,24. Lamentablemente, ni grabaciones de celulares ni mediciones de potenciales de campo locales tienen la resolución espacial para determinar donde la actividad está ocurriendo dentro de células individuales o medir la actividad de cada célula dentro de una población. Más recientemente, calcio tintes y GECIs han sido empleados para eludir estos problemas25,26.

En el pez cebra, GECIs han demostrado para ser un poderoso enfoque para examinar la función de la célula de pelo debido a la relativa facilidad de creación de pez cebra transgénico y la claridad óptica de larvas27. En larvas de pez cebra, las células ciliadas están presentes en el oído interno, así como el sistema de línea lateral. La línea lateral se compone de rosetón-como racimos de células de pelo llamados neuromasts que se utilizan para detectar los cambios locales en el movimiento del agua (figura 1). La línea lateral es particularmente útil ya que se encuentra externamente a lo largo de la superficie de los peces. Este acceso ha hecho posible estimular las células de pelo y medir señales de calcio ópticamente en larvas intactas. En general, la facilidad de transgénesis, transparencia de las larvas y el acceso sin precedentes de las células ciliadas de la línea lateral han hecho pez cebra un modelo valioso para estudiar la actividad de las células de pelo en vivo. Esto es una ventaja significativa en comparación con sistemas de mamíferos en el que las células ciliadas están rodeadas por estructuras óseas del oído interno. Esta falta de acceso ha hecho muy difícil adquirir funcionales medidas en vivo de mamíferas células de pelo.

El protocolo descrito aquí describe cómo monitorizar los cambios de canal y presynapse dependiente MET en calcio dentro de las células de pelo individuales y entre las células dentro de neuromasts en pez cebra larvas. Este protocolo utiliza una línea establecida de pez cebra transgénico que expresa una GCaMP6s localizada en la membrana bajo el control de la célula de pelo específicos myosin6b promotor28. Esta localización de membrana posiciones GCaMP6s para detectar la afluencia de calcio a través de canales iónicos situados en la membrana plasmática que son críticos para la función de la célula de pelo. Por ejemplo, GCaMP6s localizados en la membrana puede detectar calcio afluencia mediante MET canales en paquetes del pelo apical y a través de CaV1,3 canales cerca de cintas sinápticas en la base de la célula. Esto contrasta con el uso de GECIs localizadas en el citosol, como citosólicas GECIs detectan señales de calcio que son una combinación de MET y CaV1.3 canal actividad, así como aportes de calcio de otras fuentes (por ejemplo,, tienda soltar). Este protocolo describe cómo inmovilizar y paralizar larvas transgénicas GCaMP6s antes de la proyección de imagen. Luego describe cómo preparar y utilizar un chorro de fluido a los paquetes del pelo para estimular las células ciliadas de la línea lateral en una manera controlada y reproducible. Se presentan datos representativos que pueden lograrse utilizando este protocolo. También se presentan ejemplos de datos que representan los artefactos de movimiento. Se describen los experimentos de control que se utilizan para verificar los resultados y excluir artefactos. Por último, se describe un método para visualizar las señales de calcio espacial en el software de Fiji. Este análisis de Fiji es adaptado de métodos de visualización establecido previamente desarrollados usando MATLAB5. En general, este protocolo describe una técnica de preparación de gran alcance que utiliza GECIs en pez cebra larval para medir y visualizar la dinámica de calcio de la célula de pelo en vivo.

Protocol

Todos los trabajos de animales fue aprobado por el Comité de uso de animales en los institutos nacionales de salud bajo protocolo de estudio animal #1362-13. Nota: Este protocolo tiene aproximadamente 0,5 a 1 hora para terminar con el sin interrupciones si las soluciones y el equipo preparados y establecidos de antemano. Este protocolo está optimizado para Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)5,29 larvas de pez cebra en la post-fertilización 3-7 días (PD). Esta línea transgénica expresa una GCaMP6s localizada en la membrana (pez cebra codón optimizado) específicamente en todas las células de pelo del pez cebra. Antes de la proyección de imagen, las larvas se crían en el búfer de embrión (E3) bajo condiciones estándar. Consulte la Tabla de materiales para los números de catálogo de todos los equipos y medicamentos necesarios para la ejecución de este protocolo. 1. preparación de soluciones Preparar 1 mL de α-Bungarotoxina (125 μm), que se utiliza para paralizar las larvas de pez cebra durante proyección de imagen funcional. Añadir 968.6 μl de agua ultrapura estéril y 33,4 μL de rojo de fenol de 1 mg de α-Bungarotoxina (botella entera). Hacer alícuotas μl 100 y almacenarlos a-20 ° C.PRECAUCIÓN: Utilice guantes y hacer los preparativos en la capilla al manipular polvo de α-Bungarotoxina. También se recomiendan guantes al manipular la solución de α-Bungarotoxina. Preparar 1 L de tampón de embrión x 60 (E3). Añadir 17,2 g de NaCl y 0,76 g de polvo de KCl a 954,4 mL de agua ultrapura. Añadir 19,8 mL de 1 M CaCl2, 19,8 mL de 1 M MgSO4y 6 mL de tampón de HEPES de 1 M a la solución. Almacenar la solución x E3 60 a 4 ° C hasta por 6 meses. Preparar 10 L de 1 x E3 (5 mM NaCl 0,17 mM KCl 0,33 mM CaCl2; 0,33 mM MgSO4, pH 7,2), que es una solución que las larvas se propagan en antes de la proyección de imagen funcional. Añadir 167 mL de solución stock de 60 x E3 a 10 L de agua ultrapura para hacer una solución de x E3 1. Almacenar la solución de x E3 1 a temperatura ambiente (RT) por hasta 6 meses. Preparar el tampón neuronal (NB) (140 mM NaCl KCl de 2 mM 2 mM CaCl2, 1 mM MgCl2; tampón HEPES 10 mM, pH 7.3), que se utiliza para sumergir a las larvas durante la proyección de imagen funcional.Nota: 1 x E3 puede utilizarse también para la proyección de imagen funcional, pero las respuestas son más robusta y fiable en NB. Combinar 28 mL de NaCl M 5, 2 mL de 1 M de KCl, 2 mL de 1 M CaCl2, 1 mL de 1 M de MgCl2y 10 mL de tampón HEPES de 1 M con 957 mL de agua ultrapura. Llevar el pH a 7.3 con 1 M NaOH. Filtro de esterilización. Almacenar a 4 ° C durante 1 mes.Nota: Traer a RT antes de usar solución. Preparar acciones de MS-222 (Metanosulfonato, 0.4%), que se utilizan para anestesiar las larvas. Disolver 400 mg de sal de metanosulfonato de etilo 3-aminobenzoato y 800 mg de Na2HPO4 en 100 mL de agua destilada. Ajustar el pH a 7. Almacenar a 4 ° C. Uso de 0.04% MS-222 para anestesiar las larvas durante la inyección de la inmovilización y la α-Bungarotoxina. 2. preparación de la proyección de la cámara y los pernos de Preparar la sala de proyección de imagen (figura 2A). Aplique una capa delgada de grasa de silicona de vacío alta a la parte inferior de la cámara de perfusión a lo largo de los bordes de la plaza a la que se adhiere el cubreobjetos. No dejar vacíos en la grasa. Presione firmemente hacia abajo alrededor de los bordes del cubreobjetos para sellar a la cámara de proyección de imagen. Limpie el exceso de grasa lejos.Nota: Se recomienda una jeringa de 5 mL con una punta de micropipeta de 200 μL para la aplicación de grasa. Preparar el encapsulante de silicona para llenar la cámara. Una relación 10:1 (en peso) de base para agente endurecedor de la mezcla. Mezclar bien pero suavemente, usando una punta de micropipeta para crear burbujas de mínima. Vierta el encapsulante de silicona sobre el cubreobjetos colocado hasta que esté nivelada con la superficie de la cámara. Aproximadamente 3 g de encapsulante llenará la cámara. Cuidadosamente golpee la cámara contra una superficie plana manteniendo horizontal, o usar una punta de micropipeta (bajo un estereomicroscopio) quitar o tirar burbujas hasta el borde de la cámara. Coloque la cámara en un horno de laboratorio durante la noche a 60 – 70 ° C. Colocar la cámara dentro de una caja ventilada para que aire caliente no se sopla directamente en el encapsulante para evitar la creación de ondas. Utilice fórceps fino y alambre de tungsteno para las clavijas usadas para inmovilizar las larvas a través de la cabeza y la cola (figura 2B1) de la manera el encapsulant endurecido. Para hacer alfileres de cabeza, sostenga un trozo de alambre de tungsteno de 0,035 mm en un lado bajo un estereomicroscopio. Utilizando fórceps fino en la otra mano, doble el alambre 1 mm hacia arriba desde el extremo a 90°. Intercambiar las pinzas tijeras finas y cortar 1 mm después de la curva para crear el pin. Repita el paso 2.3.1 mediante un alambre de 0.025 m m para hacer cola pines, pero dejar 0,5 mm de alambre a cada lado de la curva. Utilice pinzas para introducir los pasadores en el encapsulant endurecido en la cámara (para almacenamiento). 3. preparación de agujas para la parálisis y la estimulación Preparar las agujas de inyección de corazón con Capillares de vidrio de un filamento. Tire las agujas de un diámetro interior de la punta de 1 a 3 μm (figura 2C). Preparar el chorro de líquido agujas con capilares de vidrio sin un filamento. Tire las agujas con la punta delgada y larga que puede romperse con el diámetro de la punta correcta. Romper la punta delgada y larga de la aguja de fluido chorro frotando perpendicular contra otra aguja de chorro de líquido o una baldosa cerámica justo encima de donde se puede doblar la punta de la aguja para crear un diámetro interno de la punta de 30 – 50 μm [figura 2C (imagen central) y Figura 3 A2]. Asegúrese de que la rotura es incluso en la punta (figura 2C, imagen medio) y no irregulares o incluso demasiado grandes (figura 2C, imagen de la derecha) para garantizar y flujo de fluidos precisa durante la estimulación de la célula de pelo.Nota: Una pulidora de aguja puede utilizarse para reparar roturas irregulares. 4. fijando e inmovilizando la Larva imagen cámara Bañarse una larva Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) en aproximadamente 1 mL de E3 tampón que contiene 0,04% MS-222 1-2 min en la superficie de silicón encapsulante de la cámara de imágenes hasta que la larva se convierte inmóvil o no responde al tacto. Bajo un estereomicroscopio, coloque la larva en el centro de la cámara de perfusión por lo que se encuentra en su lado contra el encapsulante de silicona.Nota: Para la consistencia, siempre Monte las larvas en el mismo lado (por ejemplo, lado derecho abajo, lado izquierdo arriba) (figura 2B1). Con unas pinzas finas, traen un perno de cabeza de 0,035 mm abajo perpendicular a la cámara y de la larva. Inserte el perno de cabeza entre el ojo y la vesícula ótica y abajo en el encapsulante (figuras 2B1 y 2B2). Utilice un segundo conjunto de pinzas para estabilizar la larva a lo largo de su lado dorsal o ventral y la fijación. Asegúrese de que la parte horizontal del perno entra en contacto con la larva y no presiona en el encapsulante. El perno del ángulo ventral (figura 2B1) o apuntando ligeramente hacia la parte anterior de los peces para evitar la interferencia con corazón posterior inyección y proyección de imagen de la célula de pelo. Usando las pinzas, inserte un pasador de la cola de 0.025 m m el notocordio tan cerca como sea posible hasta el final de la cola (figura 2B1).Nota: Tenga cuidado para evitar estiramiento la larva. Perno de la larva plana. Ojos deben ser superpuestos (figura 2B1). Esto es muy importante para facilitar la inyección de corazón (figura 2B2-B2′, paso 5), facilitar un plano de proyección de imagen deseable (figura 1B1-B2”, pasos 8 y 9) y cuantificar la intensidad del estímulo de chorro de líquido ( Figura 3A3, paso 7). 5. inyección de α-Bungarotoxina en la cavidad del corazón a paralizar la Larva Nota: Use guantes cuando maneje α-Bungarotoxina. Centrifugue la alícuota de α-Bungarotoxina brevemente antes del uso para evitar la obstrucción de la aguja de inyección de corazón. Relleno 3 μl de solución de α-Bungarotoxina en una aguja de inyección de corazón utilizando un gel de carga punta de pipeta. Cargar la solución uniformemente hasta la punta con sin burbujas. Inserte la aguja de inyección de corazón en un sostenedor de la pipeta a un micromanipulador manual. Bajo un estereomicroscopio, posición de la aguja quede alineada perpendicularmente al eje A-p de las larvas anclados y anestesiados, apuntando hacia abajo en un ángulo de 30°. Conecta el cable porta pipeta al inyector de presión. Aplicar la siguiente configuración sugerida: Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0,5 s y Pcompensation = 5 hPa. Inyectar un bolo en la solución para probar si la punta de la aguja es patente. Busque un pequeño soplo de la solución de rojo (de rojo de fenol) para dejar la punta de la aguja. Si se comprueba que no hay color rojo, muy suavemente raspar la punta de la aguja contra el borde de un pin y vuelva a intentarlo hasta que la aguja es patente. Por otra parte, tire una aguja con una abertura más grande de la punta. Avanzar la aguja hacia el centro hasta que toque la piel fuera del corazón (figura 2B2). Presione la aguja en la larva y busque la hendidura de la célula de pigmento en la piel delante del corazón para asegurar que la aguja se coloca en el plano correcto con respecto a la larva (figura 2B2′). Avanzar la aguja aún más hasta que penetra la piel y entra en la cavidad del corazón. Tire la aguja ligeramente. Inyectar un bolo de α-Bungarotoxina en la cavidad del corazón. Mira para la inflación de la cavidad del corazón o para el tinte rojo entrar en la cavidad. Suavemente Lave la larva 3 veces con 1 mL de NB para eliminar residuos de MS-222. Nunca retire todo el líquido. Mantener la larva en aproximadamente 1 mL de NB en la cámara de perfusión.Nota: Asegurar ese latido larvas y robusto flujo sanguíneo después de la inyección de clavos y corazón y a lo largo de todo el experimento de proyección de imagen. 6. preparación del microscopio y la configuración del chorro de líquido Montar un microscopio confocal vertical usando los componentes descritos en la Tabla de materiales: un microscopio confocal con un 488 nm láser y filtros adecuados, microscopio software para controlar y coordinar la proyección de imagen y estimulación, aire x 10 objetivo, objetivo de agua x 60, escáner Objetivo piezo-Z (para pilas de z), cámara de alta velocidad, adaptador de cámara circular, etapa motorizada y adaptador de inserción de etapa. Consulte a Zhang et al29 para opciones adicionales y orientación sobre configuraciones del microscopio. Montar el chorro líquido formado por 3 componentes principales: un vacío y bomba de presión, abrazadera de presión de alta velocidad y principal etapa (también descrito en la tabla de materiales). Utilice la abrazadera de presión de alta velocidad para controlar la sincronización y duración de la descarga de presión o vacío de la etapa de cabezas y con la pipeta líquido-jet. Conecte la salida de la etapa principal a la pipeta líquido-jet titular a través de pared gruesa tubería del silicón. 7. alineación de la Larva y el chorro de líquido Nota: Hay 3 planos de interés dentro de cada neuromast: (1) las puntas de los paquetes del pelo (figura 3A3: los quinocilios, utilizado para medir la intensidad del estímulo); (2) cabello paquete MET plano (figura 1B1-B1′: la base de los paquetes del pelo apical donde se detectan las señales de calcio MET-canal-dependent); y (3) el plano sináptico (figura 1B2-B2′: donde se detectan las señales de calcio presinápticos en la base de la célula de pelo). Estos planos se describen en la figura 1A. Rellenar 10 μl de NB en una aguja de chorro de líquido bien rota (del paso 3.2) con un gel de carga punta. Cargar la solución uniformemente hasta la punta con sin burbujas. Introduzca la aguja en el soporte de la pipeta atado micromanipulador motorizado. Coloque la cámara de perfusión en un adaptador de cámara circular en la platina del microscopio.Nota: Para consistencia, coloque siempre la larva en la misma orientación (por ejemplo, la cámara que contiene la larva con su posterior hacia el chorro de líquido y ventral lateral hacia el experimentador). Mover el escenario motorizado para que la larva está en el centro del campo de visión. Gire el adaptador de cámara circular de modo que el eje A-p de la larva es aproximadamente alineado con la trayectoria de la aguja de chorro de líquido. Con contraste de interferencia diferencial y luz transmitida (DIC), traer la larva en el foco y centro en el objetivo 10 x. Plantear el objetivo 10 x. Mediante el micromanipulador motorizado, bajar la aguja de chorro de líquido en el centro del campo de visión por lo que está iluminado por la luz transmitida y apenas tocar la solución NB. Bajar el objetivo 10 x. Se centran en la larva para confirmar su ubicación. Enfocar hacia arriba a encontrar la aguja de chorro de líquido. Mueva la aguja de chorro de líquido con el instrumental quirúrgico en los ejes x e y – hasta que esté en una posición paralela a la cara dorsal de los peces. Se centran en la larva. Bajar la aguja en el eje z. Posición de la aguja por el lado dorsal del pescado y ~ 1 mm lejos del cuerpo (figura 3A1). Mueva con cuidado el adaptador de cámara circular (si es necesario) para asegurar que la aguja de chorro de líquido está alineada a lo largo de la línea media del A-p de la larva (figura 3A1). Mueva la etapa motorizada para colocar la neuromast de interés en el centro del campo de visión. Mantenga la punta de la aguja de inyección de líquido a lo largo del lado dorsal del pescado. No toque la punta de la aguja de chorro de líquido a la larva o la superficie de la cámara. Cambiar a los 60 x objetivo de agua. Asegúrese de que el objetivo se encuentra inmerso en la solución NB. Uso el foco fino para localizar un uso neuromast transmite la luz y la óptica DIC.Nota: Esta configuración está diseñada para estimular neuromasts a lo largo de la línea lateral posterior primaria. Las células de pelo dentro de estos neuromasts responden al flujo dirigido ya sea anterior o posterior. Ver el Chou et al.31 para un mapa exacto de sensibilidad líquido neuromast dentro del sistema de línea lateral. Coloque la aguja de chorro de líquido con el micromanipulador para que sea 100 μm desde el borde exterior de la neuromast (figura 3A2).Nota: Elegir neuromasts vistas claras de arriba hacia abajo (figuras 1B1′-B2′ y 3 figuraA3) en lugar de vistas laterales en ángulo (figura 1C1-C2). Una vista clara de arriba hacia abajo permite la proyección de imagen de todos los paquetes de pelo apical en un solo plano óptico simultáneo o proyección de imagen de áreas sinápticas en planos ópticos menos (figura 3A3). Enfoque hasta las puntas de los paquetes de pelo apicales (quinocilios) (figura 1A, figuras 3A2 y 3A3). La parte inferior de la aguja de chorro de líquido debe ser enfocada en este plano. Fijar la abrazadera de presión de alta velocidad del manual a modo externo para recibir la señal desde el software de imágenes. La abrazadera de presión de alta velocidad a cero pulsando el botón “zero”. Use el botón de punto de ajuste para ajustar la reclinación presión ligeramente positiva (~ 2 mmHg). Confirmar la salida del descansa de la abrazadera de presión de alta velocidad utilizando un manómetro PSI conectado a la salida de la etapa principal.Nota: Establecer una presión ligeramente positiva en reposo para evitar la absorción gradual de líquido en la aguja de chorro de líquido en el tiempo. Si el líquido entra en el tubo conectado al chorro de líquido y llega a la etapa principal, puede dañar el equipo. Determinar la presión necesaria para estimular los paquetes del pelo. Usar un 0.125 y 0.25 V (6,25 y 12,5 mmHg) de 200 – 500 ms para aplicar un estímulo de prueba (figura 3A3-A3”).Nota: La abrazadera de presión alta velocidad convierte un voltaje de entrada (de software o dispositivos que se conectan al puerto BNC en el puerto de control de pinza de presión alta velocidad) en presión que se descarga de la etapa principal y en última instancia, la aguja de chorro de líquido (1.0 V = 50 mmHg, mientras que de -1,0 V =-50 mmHg). En esta configuración (vea el paso 7.2) positivo de presión (push) desvía paquetes del pelo hacia la parte anterior, y la presión negativa (tirón) desvía paquetes del pelo hacia la parte posterior. Utilizando luz transmitida y DIC óptica junto con una barra de escala, medir la distancia de la desviación de los 6,25 y 12,5 mmHg estímulos de las puntas de los paquetes del pelo, los quinocilios (figura 1A y figuras 3A3-3”). Elegir una presión que se mueve los paquetes (como 1 unidad coherente) una distancia de aproximadamente 5 μm (figura 3A3”). Asegurar que las puntas de los quinocilios foco todo el tiempo. Mover el chorro de líquido ± 25 μm a lo largo del eje A-p de la larva para encontrar una distancia y una presión que desvía las puntas de los quinocilios 5 μm.Nota: Con GCaMP6s en larvas de PD de 3 – 7, una desviación de 5 μm debe alcanzar cerca de saturar las señales de calcio GCaMP6s y si no daña estructuras apicales pelo-paquete (figura 3A3”). Distancias de desplazamiento más pequeñas se pueden utilizar para entregar estímulos no saturar (figura 3A3′). Distancias de desplazamiento > 10 μm son difíciles de estimar ( figura 3A3” ‘) y puede ser perjudicial con el tiempo. Saturación de la señal depende de la edad de la neuromast (altura kinocilial) así como el indicador utilizado. Comprobar la permeabilidad de la aguja de chorro de líquido en cada dirección (presión o empuje y vacío/extracción) periódicamente durante la proyección de imagen. Chorro de fluido agujas obstruyen fácilmente y perder permeabilidad del vacío, pero mantengan la permeabilidad de la presión residual. Uso DIC óptica y un estímulo de prueba corta en cada dirección para comprobar permeabilidad de chorro de líquido. La muestra se centran en el plano del interés (por ejemplo, la base de los paquetes del pelo apical o la base de la célula de pelo en el plano sináptico; Figura 1 B1-B2′). 8. proyección de imagen de adquisición procedimiento opción 1: Adquisición de avión solo Nota: Todas imágenes descritas en este protocolo se realizan a TA. Configurar software de imágenes para adquirir una adquisición de marco de 80 streaming o continua con una captura cada 100 ms para alcanzar una velocidad de 10 Hz. Ajuste de ganancia, apertura y potencia del láser para optimizar la detección de señales y evitar la saturación, el fotoblanqueo y el ruido. Valores de ejemplo para un Opterra/SFC son los siguientes: energía del laser de 488 nm: 50 (plano de MET de pelo-bundle), 75 (plano sináptica); abertura de 35 μm; ganancia = 2.7; Ganancia de EM = 3900.Nota: Aplique 2 X binning si las señales son demasiado débiles o ruidosos o tienen excesiva fotoblanqueo. 2 x binning voluntad mejorar la detección de la señal a costa de resolución espacial. Seleccionar un estímulo para ofrecer en el marco de la 80 (8 s) adquisición después marco 30, 3 s.Nota: Algunos estímulos de ejemplo son los siguientes: 200 ms (+ o – 0.25 V) 2 s (+ o – 0.25 V) paso en la dirección anterior o posterior para identificar la sensibilidad direccional de cada célula de pelo; 2 s, 5 Hz de onda cuadrada (0.25 V de 200 ms, -0.25 V de 200 ms, repetido 5 veces) estimular el pelo todas las células simultáneamente. Una presión positiva (estímulo anterior) activará la mitad de las células de pelo. Una presión negativa (estímulo posterior) activará la otra mitad de las células de pelo. Asegúrese de que el dispositivo o software de estímulo devuelve la abrazadera de presión a 0 V al terminar el estímulo. Medir las respuestas de calcio mechanosensitive. Centrarse en la base de los paquetes del pelo apical (figuras 1A y 1B1-B1′) y adquisición de la imagen.Nota: Si el neuromast se ve claramente desde la parte superior hacia abajo (figura 1B1-B1′), todos los paquetes de pelo apical pueden ser reflejados al mismo tiempo en un solo plano. Medir las respuestas de calcio presinápticos. Enfoque a la base de las células de pelo (figuras 1A y 1B2-B2′) y adquisición de la imagen.Nota: Si el neuromast se ve claramente desde la parte superior hacia abajo (figura 1B2-B2’), los planos de proyección de imagen presinápticos de todas las células de pelo se pueden adquirir en 2 – 3 planos set 2 μm aparte. Tg [myo6b:ribeye-mcherry] peces transgénicos pueden utilizarse para identificar y localizar cintas presinápticos y sitios de entrada de calcio29. 9. proyección de imagen de adquisición procedimiento opción 2: Adquisición y plano Sintonice el piezo-Z atado el objetivo 60 x para adquisiciones rápidos (ms de 12 – 18). Asegúrese de que se seleccionan los ajustes de velocidad máxima. Crear una adquisición de Z-stack con un piezo-Z. Adquirir la actividad MET pelo-paquete de 5 planos con tamaño de paso de 0,5 μm. adquirir las señales presinápticas de 5 planos con tamaño de paso de 1 μm. Establecer la velocidad de fotogramas a 10 Hz. Cada marco será capturado cada 20 ms y cada pila de Z cada 100 ms. Establecer la adquisición de 400 marcos o 80 Z-pilas de 10 Hz para un 8 s adquisición de streaming. Sistema de energía del laser, la apertura y la ganancia para optimizar la detección de señales y evitar la saturación, el fotoblanqueo y el ruido. Valores de ejemplo para un sistema de Opterra/SFC son los siguientes: energía del laser de 488 nm: 75 (plano de MET de pelo-bundle), 125 (plano sináptica); abertura de 35 μm; ganancia = 2.7; Ganancia de EM = 3900.Nota: Aplicar 2 X binning si las señales son demasiado débiles,ruidoso, o tiene excesiva fotoblanqueo. 2 x binning voluntad mejorar la detección de la señal a costa de resolución espacial. Seleccionar un estímulo para ofrecer durante la adquisición a partir de marco 150, después de 3 s. Seguir el protocolo como se describe anteriormente para la adquisición de plano único, pero centro de la pila de Z en los planos apicales o basals (pasos 8.4 y 8.5). 10. control: Bloque farmacológico de calcio todo evocados señales Nota: BAPTA (1,2-bis(o-aminophenoxy) etano-N, N, N′, ácido etilendiaminotetraacético N′) el tratamiento es control crítico cuando primero establecer este protocolo. Después de completar los pasos 8 o 9, reemplace el NB con 1 mL de NB que contiene 5 mM BAPTA hender los enlaces de punta necesarios para bloquear canales MET apicales situados en paquetes del pelo. Incubar por 10-20 min a TA. Lave el BAPTA 3 veces con 1 mL de NB. Repita el paso 8 o 9. Después del tratamiento de BAPTA, no debería haber ningún cambio en el GCaMP6s de la fluorescencia en respuesta a la estimulación de chorro de líquido en los paquetes del pelo apical o plano sináptica. Si persisten los cambios en la fluorescencia GCaMP6s, estas no son señales de verdadera calcio y pueden ser artefactos de movimiento. 11. control: Bloque farmacológico de señales de calcio presinápticos (opcionales) Después de completar los pasos 8 o 9, reemplace el NB con NB que contiene 10 μm isradipina con 0.1% de dimetilsulfóxido (DMSO) para bloquear los canales de calcio tipo L en el presynapse de la célula de pelo. Incubar por 10 min a TA. Sin realizar un lavado, repita el paso 8 o 9. Después del tratamiento, todavía debe haber GCaMP6s cambios de fluorescencia en respuesta al estímulo de chorro de líquido en apicales paquetes del pelo pero no el plano sináptico. Si persisten los cambios en la fluorescencia de GCaMP6s en el plano sináptico, estas no son señales de verdadera calcio y pueden ser artefactos de movimiento. 12. representación gráfica y transformación de los datos de la imagen Nota: Uso de Fiji (12.1 – 12.1.5 los pasos) y un programa de graficación (pasos 12.2 – 12.2.3) para el paso 12. StackReg, TurboReg (paso 12.1.3), tiempo serie analizador V3 (medidas 12.1.4–12.1.6), y plugins de Fiji también (véase Tabla de materiales). Abrir una secuencia de imágenes en Fiji, un solo plano serie (80-marco solo plano) o series de tiempo Z-stack (400-marco multi plano). Haga clic en “Archivo”, seleccione “Importar” en el menú desplegable y haga clic en “Secuencia de imágenes.” Para una serie de veces Z-stack, Z-proyecto cada vez punto (5 aviones por punto) para crear una secuencia de imágenes de marco de 80. Haga clic en “Imagen”, seleccione “Pilas” en el menú desplegable, seleccione “Herramientas” del menú desplegable y haga clic en “Agrupadas Z-proyecto”. Seleccione “Intensidad media” como el método de proyección y entrar en “5” para el “Tamaño de grupo”.Nota: Cada plano dentro de la pila de Z puede analizarse por separado para obtener más información espacial. Quitar el primer 1 s (10 marcos) de 8 s (80 capítulos) de adquisición de la imagen. Haga clic en “Imagen”, seleccione “Apilados” en el menú desplegable, seleccione “Herramientas” del menú desplegable y haga clic en “Make Substack”. Entrar en “11-80” por “Lonchas”.Nota: Este substack se denominará stk1. Registrar la secuencia de imágenes (stk1) usando el plugin de StackReg32. Haga clic en “Plugins”, seleccione “StackReg” y seleccione “Traducción” como el método de registro para la serie 70-marco de tiempo.Nota: Este substack registrado se denominará stk2. Usar el plugin veces serie analizador V3 para extraer las medidas de intensidad (F) GCaMP6. Poner una región de interés (ROI) en paquetes del pelo apical o sitios presinápticos en stk2. Consulte el sitio web de ImageJ (véase Tabla de materiales para el enlace) para obtener instrucciones sobre cómo utilizar tiempo serie analizador V3.Nota: Usar un circular 1 – 2 μm ROI para paquetes del pelo apical y una circular 3 – 5 μm ROI para el plano sináptico (figuras 4A1 y 4A2). Seleccione los parámetros de medición. Haga clic en “Analizar”, seleccione “Sistema de medición” y asegúrese de que sólo “significa valor de gris” es seleccionado. En el administrador de ROI, seleccione ROIs todos y utilizar la función de medida múltiples para generar valores de intensidad (F) para cada ROI en la serie de tiempo. En ROI Manager, haga clic en “Más >>” y seleccione “Multi medida” en el menú desplegable. Valores de trama (F). Pegar los valores de (F) de los resultados del “Multi medida” en un programa de gráficos para crear un gráfico X-Y (figuras 4A1 ‘y 4A2’).Nota: Crear (X) valores manualmente o utilizar la marca de tiempo de los metadatos. Cuantificar la base (Fo) para cada ROI promediando los valores de (F) en el programa de gráficos de los fotogramas de pre-estímulos 1 – 20. Para cada ROI, restar (Fo) de los valores de (F) en cada punto para crear valores ΔF (F-Fo). Huelva, si lo desea. Calcular y trazar ΔF/Fo. Para cada ROI, divida la medida de la ΔF por (Fo) y Huelva (4A1 figuras ” y 4A2”). 13. elaboración y representación de mapa de calor de las señales de calcio Spatio-temporal de la imagen Nota: Trabajo previo para crear calor espacial mapa representación de señales de calcio en el pez cebra células de pelo de la línea lateral han utilizado software personalizado escrito en Matlab5,28. Este análisis ha sido adaptado para el software de análisis de código abierto Fiji33. Fiji de uso para todos los pasos descritos a continuación. Plugins StackReg y TurboReg Fiji también están (véase Tabla de materiales). Realice los pasos 12.1 – 12.1.3 para cada Z-pila o serie de tiempo de solo plano crear el substack domicilio conocido como stk2. Utilizar stk2 para crear una imagen de línea de base. Haga clic en “Imagen”, seleccione “Pilas” en el menú desplegable y seleccione “Proyecto Z”. Seleccione “Intensidad media” para “Tipo de proyección” y escriba “1” para “Start slice” y “20” para la “Parada de slice”.Nota: Esta proyección Z se denominará baselineIMG. Temporal bin la secuencia de imágenes (F) 70-marco (stk2) en recipientes de 0,5 s 14. Haga clic en “Imagen” seleccione “Pilas” en el menú desplegable, seleccione “Herramientas” del menú desplegable y haga clic en “Proyecto Z agrupados”. Seleccione “Intensidad media” como el “método de proyección” y escriba 5 de “Tamaño de grupo”.Nota: Se referirán a esta proyección de Z agrupada como stk2bin y F en la figura 5. Restar el valor del píxel de referencia (baselineIMG) de la secuencia desechada de imagen (F) (stk2bin) para crear una secuencia de imágenes ΔF. Haga clic en “Proceso” y seleccione “Calculadora de imagen” en el menú desplegable. Seleccione stk2bin como “Image1″ y baselineIMG como”Image2.” Seleccione “Sustraer” de “Operación”.Nota: Esta proyección Z restar base se conoce como stk2binBL y F-BL = ΔF en la figura 5. Elija una tabla de búsqueda (LUT) de elección para mostrar secuencia de imágenes ΔF (stk2binBL). Haga clic en “Imagen”, seleccione “Tablas de búsqueda” en el menú desplegable y haga clic en una LUT de elección.Nota: “Rojo caliente” es el LUT utilizado en la figura 5. Esta base resta Z-proyección con LUT se conoce como stk2binBL-LUT y ΔF LUT en la figura 5. Establecer los valores de brillo máximo (max) para stk2binBL-LUTy mínimo (min). Haga clic en “Imagen”, seleccione “Ajuste” y haga clic en “Luminosidad”. Establezca el valor de min para eliminar ruido de fondo de stk2binBL-LUT. Establecer los valores máximos para conservar las señales de interés, pero evitar la saturación de la señal [por ejemplo, 200 a 1600 (gama de intensidad de imagen de 12 bits = 0 a 4095)].Nota: Use los mismos valores min y max cuando hace comparaciones visuales o representaciones. Un bar LUT ΔF calibración puede generarse en Fiji para cada secuencia de imágenes LUT (p. ej., stk2binBL-LUT). Haga clic en “Analizar”, seleccione “Herramientas” y haga clic en “Barra de calibración”. Desmarque “Overlay” para generar una imagen separada, individual, con la barra de calibración de LUT para referencia. Convertir tanto el ΔF (stk2binBL-LUT)con la imagen deseada de LUTand el temporal desechado (F) (stk2bin) secuencias RGB. Haga clic en “Imagen”, seleccione “Tipo” y haga clic en “Color RGB”.Nota: Las proyecciones-Z convierte RGB se hará referencia a como stk2binBL-LUT-RGB y RGB stk2bin, respectivamente. Superposición de las imágenes LUT ΔF (stk2binBL-LUT-RGB) sobre imágenes (F) desechados (RGB stk2bin). Haga clic en “Calculadora de imagen” y luego “Proceso”. Seleccione stk2bin-RGB como Image1 y stk2binBL-LUT-RGB como Image2. Seleccione «Transparente cero» para el «Funcionamiento».Nota: Si hay demasiado ruido o fondo en la superposición LUT ΔF, repita el paso 13.3 para aumentar el valor de min. Si hay saturación, repita el paso 13.3 y aumentar el valor máximo. 14. imagen Spatio-temporal y procesamiento representación de mapa de calor utilizando una Macro de Fiji Nota: La siguiente sección se refiere a una macro de Fiji llamada LUToverlay basado en Paso 13 que creará automáticamente la representación de mapa de calor espacial de señales GCaMP6s. Este análisis requiere el análisis de código abierto software Fiji33 y los plugins StackReg y TurboReg Fiji (véase Tabla de materiales). Descargar la macro de superposición de LUT de Fiji (LUToverlay.ijm) que acompaña a este protocolo (véase Archivo de codificación complementaria). Abrir series de tiempo múltiples plano o serie de tiempo de solo el plano (ver paso 12.1). Haga clic en “Plugins”, seleccione “Macros”, haga clic en “Ejecutar” y seleccione la macro LUToverlay. Un cuadro de diálogo aparecerá con el texto “Dime acerca de su adquisición de la imagen”.Nota: Para el cuadro de diálogo, los números actuales son valores sugeridos y pueden cambiar según la configuración utilizada por el experimentador. Los valores indican en el cuadro y a continuación se establecen una serie de tiempo un avión con 400 imágenes y 5 planos por punto (paso 9). Después de “Número de planos por punto”, introduzca el número de planos por punto (por ejemplo, para paso 12.1.1 utilizando un multi-avión 400 series de tiempo con 5 aviones por punto, ingrese “5”). Para una adquisición de plano único (por ejemplo, paso 8) ingrese “1”.Nota: En los restantes cuadros de diálogo, de una serie de tiempo de múltiples planos, “los puntos de tiempo” se refiere a las imágenes número en la pila de Z proyectada (por ejemplo, para paso 12.1.1 es 80 puntos de tiempo). Utilice la opción “Definir la gama para analizar” para eliminar la primer 1 s de la secuencia de imágenes (por ejemplo, para seleccionar Paso 12.1.2 “11-80” a retirar los primeros 10 marcos y primer 1 s). Después “definir los puntos de tiempo en línea de base”, introduzca el número de imágenes que se utilizará para crear la imagen de la línea de base [por ejemplo, para el paso 13.2., escriba “20” para utilizar las imágenes del previo estímulos (11-30)]. Después de “Puntos de tiempo por bin temporal” Introduzca el número de imágenes a bin para el recubrimiento. (por ejemplo, para paso 13.2.2. Seleccione “5” para crear 14 cubos de 0.5 s). Después de “Min intensidad” y “Máxima intensidad” entran los valores mínimo y máximo brillo que eliminar ruido de fondo (mínimo) y conservar las señales de interés evitando saturación (máxima). Después de “elegir una tabla de búsqueda”, selecciona el LUT para el recubrimiento. Haga clic en “Aceptar”.Nota: La macro terminará analizando las imágenes según las instrucciones que se indican en el paso 13. Las imágenes generadas por la macro también serán nombradas según las instrucciones en el paso 13. Cierre todas las ventanas de análisis antes de procesar una nueva secuencia de imágenes.

Representative Results

Después de myo6b:GCaMP6s-peces transgénicos caax debidamente inmovilizados y el estímulo de chorro de líquido se suministra a las células ciliadas de la línea lateral, señales de calcio sólido pueden visualizarse y medición(figuras 4 y 5, en 2 X binning). Durante la estimulación de chorro de líquido, calcio señales o bien se pueden medir en los paquetes del pelo apical, donde MET canales abiertos en respuesta a estímulos, o en la base de las células de pelo, donde presináptica Cav1.3 los canales de calcio activan la neurotransmisión. Un ejemplo representativo de respuestas de calcio en estas regiones con un neuromast individual se muestran en la figura 4A1-A2”. En este ejemplo, fue entregado un estímulo de chorro de líquido 2-s de 5 Hz para activar todas las células de pelo dentro de la neuromast representativa. Durante el estímulo, se pueden detectar señales de calcio sólido en paquetes del pelo (figura 4A1-A1”, se muestran las respuestas de 8 paquetes del pelo). En este sistema, casi todas las células de pelo Maduritas muestra apical afluencia de calcio5. Por el contrario, dentro de la misma neuromast, hay señales de calcio detectables en el plano basal, synaptic en sólo un subconjunto (~ 30%) de las células ciliadas (figura 4A2-A2”, aparecen 4 células presinápticas respuestas)5. 4 verde ROIs Mostrar células sin señales de calcio presinápticos significativa (figura 4A2-A2”) a pesar de las señales de calcio apical robusta (figura 4A1-A1”). En este ejemplo (figura 4A1-A2”), color ROIs coinciden paquetes del pelo en el plano apical de MET (figura 4A1) con sus cuerpos celulares en el avión sináptico basal (figura 4A2). Este ejemplo pone de relieve cómo ambas señales de calcio presinápticos y dependiente MET pueden medirse dentro de las células individuales del pelo y entre poblaciones de células de pelo. Las señales de calcio en ambos los paquetes del pelo y en la presynapse se pueden trazar gráficamente como materia prima (F) GCaMP6s intensidad o intensidado GCaMP6s ΔF/F (consulte el paso 12, figuras 4A1′-A1” y 4A2′-A2”). Los gráficos de GaMP6s (F) destacan que puede variar la intensidad de fluorescencia basal de cada célula (4A1 figuras ‘ y 4A2′). En los gráficos ΔF/Fo GCaMP6s, cada célula se normaliza a su valor basal y el cambio de intensidad relativa de la línea de fondo se traza (4A1 figuras ” y 4A2”). En ambos el (F) y ΔF/Fo GCaMP6s parcelas, las señales de calcio en el paquete de pelo apical y basal plano presináptica inician con la aparición del estímulo (caja gris) y disminución exponencialmente después de que el estímulo termina. Durante el estímulo, las señales de calcio en paquetes del pelo aumentando rápidamente y saturar si no cambia la fuerza de la desviación (figura 4A1-A1”). En cambio, dentro del subconjunto de células ciliadas con las señales de calcio detectables en el plano sináptica, las señales de calcio aumentan gradualmente y son menos propensas a la saturación (figura 4A2-A2”). En las células de pelo sin señales de calcio presinápticos (ROIs verdes), las señales de calcio permanecen cerca de línea de base. Además de estas representaciones gráficas (figura 4), señales de calcio se pueden visualizar espacialmente dentro de la neuromast entera durante el curso del tiempo de la grabación. En la figura 5 se muestra un ejemplo de una representación espaciotemporal presináptica GCaMP6s señales en el plano basal de un neuromast. En la figura 5, se describen los pasos principales para procesar una secuencia de imágenes para visualización espacial como se describe en el paso 13. En primer lugar, las imágenes raw de GCaMP6s (F) se clasifica temporal [figura 5: fila 1 (se muestran 5 de los 14 contenedores); Paso 13.2.1]. Entonces, la imagen de la línea de base, calculada a partir de marcos de estímulos previo (Paso 13.2), se resta de las señales de fluorescencia (F) GCaMP6s para obtener imágenes ΔF (figura 5: fila 2; Paso 13.2.2). A continuación, las imágenes de escala de grises ΔF se convierten en un color LUT (figura 5: fila 3, rojo caliente LUT; Paso 13.3). Por último, las imágenes ΔF con la conversión de LUT son overlaid en el temporal desechadas imágenes de (F) (figura 5, primera fila) para revelar las señales espacio-temporal dentro de la neuromast durante el estímulo (figura 5: fila 4; Paso 13.4). Los mapas de calor de ΔF GCaMP6s señales proporcionan tanto información espacial y temporal que no es fácil analizar fuera de solo ROIs y los gráficos utilizados en la figura 4. Mapas de calor pueden ayudar a visualizar la información espacio-temporal crítica, incluyendo subcelular información sobre el inicio y la duración de las señales de calcio dentro de cada célula de pelo, así como las diferencias entre las células de pelo dentro de todo el tiempo y la intensidad de neuromast. Es importante verificar que los gráficos y mapas de calor espacial representan las señales de calcio verdadero y no son artefactos por movimiento. En este protocolo, artefactos de movimiento pueden ser el resultado de la excesiva deriva o movimiento de la larva o movimiento debido a estimulación de chorro de líquido. Todos estos artefactos son desafiantes para eliminar por completo en esta preparación en vivo. Mientras que el registro de secuencias de imágenes (paso 12.1.3) puede corregir para la mayoría del movimiento en x y ejes, secuencias de imágenes con movimiento excesivo en el eje z debe identificada y eliminada del análisis. Artefactos de movimiento son fáciles de identificar por graficar las señales de calcio. Se observan ejemplos de los cambios de intensidad de GCaMP6s que son artefactos y no son verdaderas señales de GCaMP6s en el ápice (figura 4B1′-B1”) y base (figura 4C1’-C1”) de las células de pelo. En los paquetes del pelo apical, artefactos de movimiento son comunes cuando el estímulo de chorro de líquido es demasiado fuerte (figura 3A3” ‘). Durante estos estímulos excesivamente fuertes, el plano apical de paquete de pelo puede mover fuera de foco durante la estimulación de chorro de líquido entonces volver al plano focal original después de que termina el estímulo (figura 4B1′-B”). Esto hace difícil medir con precisión las señales de calcio dependiente de la MET apicales. Un ejemplo de los artefactos de movimiento de pelo-bundle puede verse en la figura 4B1′-B1”. Aquí, los gráficos muestran una disminución de las señales de GCaMP6s durante el estímulo (caja gris) cuando los paquetes del pelo están fuera de enfoque. Después del estímulo, las señales de GCaMP6s se incrementan rápidamente como los paquetes del pelo regrese a su posición original y volver a centrarse. Esto contrasta con el ejemplo en la figura 4A1′-A1” en el que las señales de calcio apical aumentan en el inicio del estímulo y disminuyen cuando termina el estímulo. Mientras que el movimiento debido a los estímulos de chorro de líquido excesiva también puede mover el plano sináptico fuera de foco, este tipo de artefacto de movimiento es menos común en este plano. En cambio, cambios en el foco en el eje z por movimiento o deriva de la larva son las causas más comunes de los artefactos de movimiento. Movimiento de larvas o deriva puede afectar las mediciones de GCaMP6s en el ápice y la base de las células de pelo. En la figura 4se muestra un ejemplo de movimiento larvario que aumenta la GCaMP6s en el plano basal, sináptico durante el estímuloC’-C”. Artefactos de movimiento (figura 4C1′-C1”) puede ser distinguido de verdaderas señales presinápticas (figura 4A2′-A2”) examinando el curso temporal de las señales de GCaMP6s. En lugar de aumentar o disminuir exponencialmente con el estímulo (figura 4A2′-A2”), los aumentos de señal de GCaMP6s inducida por el movimiento tienen un cuadrado forma y suben y bajan bruscamente con la aparición y desplazamiento del estímulo, respectivamente () Figura 4 C1′-C1”). Además de examinar cuidadosamente el curso temporal de las señales GCaMP6s, experimentos de control utilizando la farmacología puede utilizarse para diferenciar cierto GCaMP6s señales de artefactos de movimiento. Por ejemplo, BAPTA (paso 10) puede aplicarse para hender los punta-links que se requieren para la función de MET-canal en paquetes del pelo. BAPTA debe eliminar tanto líquido-jet-evocado de la afluencia del calcio de MET-canal-dependent apical, así como la afluencia de calcio presinápticos, basal posterior a través de canales de Cav1.3. En el ejemplo de señales de calcio verdad evocada por el estímulo (figura 4A1-A2”) durante el estímulo de chorro de líquido, se eliminarían todos los cambios en la fluorescencia GCaMP6s en los planos apicales y basales después del tratamiento de BAPTA. Por el contrario, los cambios en GCaMP6s de la fluorescencia debido a movimiento como se muestra en la figuras 4B1′-B1” y 4 C 1′-C1” no sería eliminado por el tratamiento BAPTA. Además de BAPTA para eliminar todas las señales GCaMP6s evocado por el estímulo, puede aplicarse la isradipina (paso 11) bloquear específicamente afluencia de calcio 1,3 dependientes devCa en el plano basal sináptico dejando apical calcio MET-canal-dependientes afluencia intacto5. Después de aplicación de isradipina, en un neuromast individual con sin artefactos de movimiento, cambios en la fluorescencia GCaMP6s en paquetes del pelo apical (figura 4A1′-A1”) durante el estímulo de chorro de líquido sería inalterado, mientras todos GCaMP6s sináptica se eliminarían los cambios de la fluorescencia en la base (figura 4A2′-A2”). Cualquier cambio en la señal GCaMP6s en el plano sináptico después de la aplicación de la isradipina (e.g.,figura 4C1-C1 ‘) correspondería probablemente a artefactos de movimiento. Figura 1 : Descripción de un neuromast de la línea lateral y de planos de proyección de imagen funcionales. (A) el diagrama a la izquierda muestra una vista lateral de un neuromast con cuatro cuerpos de la célula de pelo (negro) contacto postsynaptic neuronas aferentes (azul). Cintas (verde) atar vesículas en presynaptic sitios activos dentro de cada célula. Apical a cada cuerpo de la célula es un conjunto de estereocilios (1 μm) que contienen canales MET. Cada paquete de pelo tiene un kinocilium que transfiere la fuerza mecánica del movimiento del agua a la base del paquete del pelo. El diagrama de la derecha representa el mismo modelo en una vista de arriba hacia abajo. En este punto de vista de arriba hacia abajo, negro se utiliza para indicar las cuatro casillas el diagrama a la izquierda, y gris se utiliza para indicar a otras células en el neuromast. Dentro de este modelo y estos 2 puntos de vista, se destacan tres planos importantes: (1) las puntas de los paquetes del pelo (quinocilios) utilizados para cuantificar la magnitud de la desviación de pelo-paquete, (2) el plano apical de la MET en la base de los paquetes del pelo donde entra calcio a la célula durante la estimulación y (3) el plano sináptico en la base de la celda donde se introduce calcio cerca de cintas sinápticas. (B1-B1′) DIC y GCaMP6s imágenes de arriba hacia abajo del plano de la MET en la base de los paquetes del pelo, donde se pueden grabar señales de calcio dependiente de mechanosensation. (B2-B2′) DIC y GCaMP6s arriba a abajo las imágenes de la misma neuromast como B1-B1′, pero en la base de la neuromast en el plano sináptico, donde se pueden detectar las señales de calcio presinápticos. (C1-C2) Imágenes de una neuromast expresa GCaMP6s donde las larvas se monta mal. En este ejemplo, el plano apical de MET (C1) y el plano sináptica (C2) en la base de la célula se colocan en un ángulo debajo del nivel óptimo. Esta posición no permite los paquetes del pelo a ser reflejada en un solo plano, y muchos más planos de proyección de imagen son necesarios para capturar la actividad en todas las sinapsis dentro de este neuromast en comparación a B1-B2’. Las imágenes son de las larvas de PD 5. La barra de escala en C2 corresponde a todas las imágenes de B1-C2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2 : Proyección de imagen cámara, procedimientos de inyección de montaje y corazón de pez cebra y agujas. (A) se muestra es una cámara de proyección de imagen con una larva (delimitada por un rectángulo discontinuo) en el centro sobre el encapsulante de silicona. (B1) Se muestra es una larva de PD 5 inmovilizado por dos pernos. Un alfiler de cabeza grande se coloca perpendicular al cuerpo sólo posterior a la vista. Los dos ojos se superponen completamente por lo que el ojo inferior es obscurecido totalmente por el superior del ojo. Un perno pequeño cola intersecta la notocorda en la cola. La larva es plana y no torcida. (B2) Para paralizar la larva, una aguja de inyección de corazón es orientado perpendicular al cuerpo y junto al corazón. La aguja de inyección del corazón debe póngase en contacto con la célula de pigmento delante el corazón. (B2′) Depresión de la aguja en la piel causa la hendidura de la célula de pigmento delante el corazón. (C) agujas en orden de izquierda a derecha: ejemplo de una aguja de inyección de corazón con una abertura de unos 3 μm; ejemplo de una buena aguja de chorro de líquido con una abertura de aproximadamente 50 μm; ejemplo de una aguja mal rota de chorro de líquido que es grande y dentado y probable producir estímulos excesivo e irregulares. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3 : Líquido-jet alineación, colocación y calibración de estímulo. (A1) Es una larva con la cabeza hacia a la izquierda y la cola a la derecha, y una aguja de chorro de líquido orientado paralelo al eje A-p del cuerpo del pez cebra. Esta aguja de chorro de líquido se alinea para estimular los neuromasts que responden a la anterior (empuje/presión) y posterior (pull/vacío) dirigida flujo flúido. (A2) Es un neuromast (delimitada por la línea discontinua blanca) y consejos de paquetes del pelo apical (quinocilios) en el lado izquierdo del panel y la aguja de chorro de líquido en el lado derecho del panel. El chorro de líquido está situado aproximadamente 100 μm desde el borde de la neuromast. (A3-A3” ‘) Las puntas de paquetes del pelo apical (quinocilios) son desviados diferentes distancias variando las presiones de fluido-jet estímulo. Se muestra la trayectoria de la punta de un solo kinocilial para 1.5 μm (A3’) y 5 μm (A3”) distancias de desviación. El círculo negro indica la posición de reposo de la kinocilium. Es importante que quinocilios no se desvía demasiado lejos, de lo contrario la intensidad del estímulo no puede ser cuantificada confiablemente y puede llegar a ser perjudicial (A3” ‘). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4 : Señales de GCaMP6s presinápticas basals durante la estimulación de chorro de líquido en las células ciliadas de la línea lateral y apical se reunió. (A1-A2”) GCaMP6s cambios de intensidad durante la estimulación de chorro de líquido dentro de un neuromast representativo. Las imágenes de la izquierda muestran el plano apical de MET (A1) y plano sináptica basal (A2) dentro de la misma neuromast. El color de ROIs en A1 y A2 se utiliza para trazar el curso del tiempo de (F) y gráficos de intensidad de GCaMP6s ΔF/F a la derecha de cada imagen. (B1-B1”) Ejemplo de una secuencia de imágenes MET apical con exceso de movimiento durante la estimulación de chorro de líquido. La imagen de la izquierda (B1) muestra las ROIs solía parcela (F) y gráficos de intensidad de GCaMP6s ΔF/F a la derecha. (C1-C1 ‘) Ejemplo de una secuencia de imágenes en el plano basal sináptico que muestra movimiento artefactos y GCaMP6s señal de cambios que no son verdadero calcio señales. La imagen de la izquierda (C1) muestra las ROIs solía parcela (F) y gráficos de intensidad de GCaMP6s ΔF/F a la derecha. El cuadro gris en cada gráfico representa la duración del estímulo de chorro de líquido durante la secuencia de cada imagen. Un estímulo de chorro líquido de 5 Hz 2-s fue utilizado por ejemplo en A1-A2” y B1-B1”. En C1-C1 ‘, se utilizó un estímulo de paso anterior s 2. El eje Y para gráficos de GCaMP6s (F) representa a unidades arbitrarias (A.U.) obtenidas de mediciones de intensidad de imagen de Fiji. Todos los ejemplos son de larvas en el dpf 4-5. Barra de escala = 5 μm para todas las imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 5 : Visualización espaciotemporal de señales GCaMP6s presinápticas durante estimulación de chorro de líquido. Se describen los pasos para visualizar los cambios espacio-temporales en la intensidad de la GCaMP6s en un neuromast durante el estímulo. Tiempo se representa de izquierda a derecha según la hora en la parte superior de las imágenes. La fila superior muestra 5 de las 14 papeleras temporales de una secuencia de imágenes de GCaMP6s (F) 70-marco (Paso 13.2.1). En la segunda fila se ha eliminado la línea de base (Paso 13.2) de cada imagen desechado (F) GCaMP6s para crear imágenes ΔF (Paso 13.2.2). En la tercera fila, imágenes ΔF se han convertido de escala de grises (segunda fila) al rojo caliente LUT (Paso 13.3). El min y max de estas imágenes LUT se establecen según el mapa de calor rojo caliente LUT de intensidad relativa ΔF (A.U.) a la derecha (Paso 13.3.1). En la fila inferior, la tercera fila ha sido superpuesta sobre las imágenes (F) en la fila superior (Paso 13.4). La barra gris en la parte superior de la figura indica la sincronización del estímulo líquido-jet s 2 de 5 Hz. El ejemplo es de un 5 larvas de PD. Una leyenda del mapa de calor rojo caliente LUT de intensidad relativa ΔF (A.U.) es mostrada a la derecha. Barra de escala = 5 μm para todas las imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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En vivo la proyección de imagen en animales intactos es inherentemente difícil. Varios pasos en este método son críticos para obtener confiable en vivo las mediciones del calcio de las células ciliadas de la línea lateral. Por ejemplo, es muy importante que la larva se cubrió y paralizada correctamente antes de la proyección de imagen para reducir al mínimo el movimiento durante la proyección de imagen. Exceso de movimiento durante la proyección de imagen puede conducir a cambios en la fluorescencia GCaMP6s que no son verdaderas señales y no corresponden a los cambios en los niveles de calcio (p. ej., figuras 4B1′-B1” y 4 C 1′ C1 ‘). Pernos de cola pueden colocarse más hacia delante para ayudar a minimizar el movimiento, aunque esto puede hacer más neuromasts posterior inaccesibles. Además, después de la inyección de corazón, alfileres de cabeza se puede girar para que la parte horizontal del perno se encuentra en la yema de huevo. Además de alterar la posición de los pernos, es también posible utilizar un arpa de rebanadas de cerebro en lugar de pernos para inmovilizar las larvas34. Cuando se coloca adecuadamente sobre las larvas, un arpa es un adicional, potencialmente menos invasivo método de inmovilización de las larvas. Movimiento significativo puede resultar de una fijación inadecuada, no realizar correctamente la inyección de corazón para entregar α-Bungarotoxina y paralizar las larvas puede ocasionar parálisis incompleta, movimiento y artefactos de movimiento en última instancia. Aunque los anestésicos comúnmente utilizados se ha demostrado que afectan la excitabilidad de las células de pelo del pez cebra, trabajo reciente ha demostrado que la benzocaína anestésica no interfiere con muchos aspectos de la actividad de la célula de pelo. Del mismo modo, más de uso general anestésico que MS-222 sólo interfiere con ciertos aspectos de la célula de pelo actividad15. Por lo tanto, debido a la naturaleza desafiante de la inyección de α-Bungarotoxina, benzocaína o aplicación de MS-222 puede resultar para ser un método útil de la alternativa de la parálisis para evitar el movimiento de la larva durante la proyección de imagen funcional del calcio.

Además de los desafíos técnicos involucrados en el presente Protocolo, incluso una muestra perfectamente montada es inútil si la larva y las células de pelo no son saludables antes y durante cada experimento proyección de imagen. Para asegurar que las larvas y las células de pelo sanas, es importante que las larvas se mantienen en buffer de E3 que está libre de desechos tales como chorions (cáscaras de huevo), residuos y microorganismos. Aunque la localización superficial de las células ciliadas de la línea lateral es ventajosa para la proyección de imagen, esta ubicación hace más vulnerables al daño celular cuando el búfer de E3 es sucia. Un ambiente limpio y acuoso es especialmente importante para las larvas jóvenes (2-4 dpf) o mutantes que no pueden mantener una piscina vertical posición y principalmente se encuentran en la parte inferior de la caja Petri. En estas situaciones, las células ciliadas de la línea lateral y el cupula Protecto que rodea los haces de pelo pueden fácilmente ser comprometidos. Aun cuando a partir de larvas sanas y las células de pelo, en el transcurso de cada experimento, es fundamental para que la larva tiene un latido del corazón y el flujo sanguíneo rápido. Si el flujo sanguíneo disminuye o se detiene, la salud de las células de pelo puede ser comprometida. En preparados comprometidos con larvas insalubres o pérdida del flujo sanguíneo, mueren las células de pelo puede identificarse varias formas: primero, por la aparición de karyopyknosis o condensación nuclear, que se manifiesta como una burbuja dentro de la célula bajo la óptica de la DIC; en segundo lugar, por la contracción de la célula y la presencia de mover rápidamente las partículas dentro del citoplasma; y tercero, cuando quinocilios consejos splay hacia fuera en diversas direcciones35. Cuando se interrumpen los paquetes del pelo, los quinocilios extendidas no acercan coherente durante la estimulación.

Esta preparación tiene varias limitaciones menores, uno de ellos que la preparación sólo sigue siendo robusta durante 1-3 horas después de que se establezca. Modificaciones como el uso de pernos más pequeños o una tajada de cerebro arpa para inmovilizar las larvas y un sistema de perfusión puede extender la vida útil de este preparado en vivo . Otra limitación es fotoblanqueo y fototoxicidad puede ocurrir después de repetidos ensayos de imagen. Una forma emocionante para superar este desafío es adaptar este protocolo para microscopía de luz de hoja. Microscopía de luz de hoja es una manera poderosa para reducir fuera de luz del foco, a menos de fotoblanqueo y fototoxicidad36. Juntos, inmovilización más apacible y menos exposición foto pueden ayudar a prolongar cada sesión de imagen. Sesiones de más proyección de imagen pueden utilizarse para examinar la duración completa de los cambios funcionales que acompañan el desarrollo y los procesos de separación de la célula de pelo y la regeneración después de lesión. Es importante señalar que, además de microscopía de luz de hoja, este protocolo puede ser adaptado a otros sistemas confocales de tipos (disco análisis de punto de 2 fotones y spinning) así como sistemas relativamente simples widefield28,34 . En general, su versatilidad lo hace una herramienta valiosa que puede ser adaptada y utilizada con múltiples sistemas de proyección de imagen de protocolo.

Si bien este protocolo puede ser adaptado y utilizado con muchos sistemas de proyección de imagen, partes de este protocolo pueden adaptadas y utilizadas (1) con otros indicadores además de GCaMP6s y (2) actividad de imagen en otras células sensoriales y las neuronas dentro de pez cebra larval. Por ejemplo, en un estudio anterior, utilizamos este protocolo a la actividad de la imagen utilizando varios indicadores genético codificados dentro de las células ciliadas de la línea lateral para detectar calcio citosólico (RGECO1), fusión de la vesícula (SypHy), voltaje de membrana (Bongwoori) y membrana calcio (caax jRCaMP1a y GCaMP6s-caax) y dentro de los procesos aferentes de la línea lateral para detectar membrana calcio (GCaMP6s-caax)5. Basándonos en nuestra experiencia usando estos indicadores, la línea transgénica que TG(myo6b:gcamp6s-caax) se describe en este protocolo ofrece un excelente comienzo para la actividad en la línea lateral neuromasts la proyección de imagen. De todos los indicadores mencionados, hemos encontrado que GCaMP6s es el más sensible y Fotoestables. Además de estas características, podemos destacar la línea transgénica Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) porque puede ser utilizado para realizar dos mediciones distintas: calcio presináptico dentro de una línea transgénica y mechanosensation célula de pelo.

La técnica que se describe en este artículo muestra cómo la proyección de imagen de calcio en la línea de lateral del pez cebra puede ser un poderoso método para estudiar cómo funcionan las células de pelo en su ambiente nativo. Este enfoque es complementario a los estudios de los mamíferos en que célula de pelo función actualmente está siendo estudiada en explantes de ex vivo . Además, el modelo de pez cebra puede continuar ser utilizado como una plataforma para probar la eficacia de indicadores genético codificados que puede aplicarse para examinar la actividad en mamíferas células de pelo.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por NIH/NIDCD investigación intramuros fondos 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). Nos gustaría reconocer Candy Wong para su asistencia por escrito la macro de Fiji. También nos gustaría agradecer a Doris Wu y Candy Wong por sus sugerencias con el protocolo.

Materials

Section 1
α-Bungarotoxin R&D Systems 2133 For paralyzing larvae prior to imaging
Phenol red Solution 0.5%  Sigma-Aldrich P0290 For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) Sigma-Aldrich A5040 For anesthetizing larvae
Section 2
Imaging chamber Siskiyou PC-R Platform to mount larvae for imaging
No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm VWR 48366-227 To seal imaging chamber 
High vacuum silicone grease Fischer Scientific 14-635-5D  For affixing of coverslip to imaging chamber
Silicone encapsulant clear 0.5 g kit Ellsworth Adhesives Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG To fill imaging chamber to create a surface to pin fish 
Oven Techne HB-1D For drying silicone encapsulant
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating wire, forceps and scissors to make pins
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For making pins 
Fine scissors  Cole-Palmer 5.5", EW-10818-00 For cutting tunsgten wire to make pins
Tungsten wire, 0.035 mm Goodfellow W005131 For head pins to immobilize larvae
Tungsten wire, 0.025 mm ThermoFischer Scientific AA10405-H4 For tail pins to immobilize larvae
Section 3
Micropipette guller Sutter Instrument Company P-97 For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles
Borosilicate glass capillaries w/ filament Sutter Instrument Company BF 150-86-10 Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection
Borosilicate glass capillaries w/o filament Sutter Instrument Company B 150-86-10 Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells
Pipette polisher Narishige MF-830 microforge To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks
Ceramic tile Sutter Instrument Company NC9569052 For scoring and evening breaking fluid-jet needles 
Sections 4 & 5
Fine forceps Fine Science Tools Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 For pinning larvae
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling heart injection needles
Stereomicroscope Carl Zeiss Microscopy Stemi 2000 with transmitted light illumination For illuminating larvae during pinning and heart injection
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
Manual micromanipulator Narishige M-152 For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin 
Magnetic stand Narishige GJ-1 For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection
Pressure injector Eppendorf Femtojet 4x To deliver α-bungarotoxin
Sections 6, 7 & 8
Confocal microscope Bruker Swept field/Opterra confocal microscope Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters
Microscope software Bruker Prairieview 5.3 To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet
10X air objective Nikon MRH00101 Low magnification for positioning of larvae and fluid jet
60X water objective Nikon MRF07620 Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm)
Piezo-Z objective scanner with controller/driver Physik Intruments instruments/Bruker 01144210/UM-Z-PZ High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy
EMCCD camera  QImaging Rolera EM-C2 EMCCD camera  Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s
Circular chamber adapter Siskiyou PC-A For holding and rotating imaging chamber on microscope stage
Motorized Z-deck stage Prior Scientific ZDN12MP Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together
Z-deck stage insert adaptor NIH Machine shop custom To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage
Fluid-jet apparatus ALA scientific instruments HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP For controlling and delivering the fluid-jet stimulus
Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft) Cole-Palmer Masterflex L/S 13, 96400-13 For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump
Motorized micromanipulator Sutter Instrument Company MP-225 For holding and positioning of needle holder for fluid jet 
Micromanipulator controller Sutter Instrument Company MPC-200 For controlling fluid-jet needle manipulator
Gel loading tips Eppendorf 5242956003 For backfilling fluid-jet needles
Glass capillary/needle holder WPI MPH315 To hold fluid-jet needles
PSI manometer Sper Scientific 840081 For measuring pressure clamp output
Section 9
BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant ThermoFischer Scientific B1204 To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals
Isradipine Sigma-Aldrich I6658 To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse
DMSO Sigma-Aldrich D8418 Solvent for pharmacological compounds
Section 10
Prism7 Graphpad Prism7 Software to plot GCaMP6 intensity changes
FIJI Schindelin, et., al.34 https://fiji.sc/ Software to process images and create spatio-temporal signal maps
Turboreg Plugin Thévenaz et., al.29  http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
StackReg Plugin Thévenaz et., al.29 http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI
Times Series Analyzer V3 Plugin Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes
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参考文献

  1. Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).
  2. Pérez Koldenkova, V., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
  3. Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
  4. Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).
  5. Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
  6. Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
  7. Eatock, R. A. Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives. Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).
  8. Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development. IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).
  9. Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
  10. Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).
  11. Ricci, A. J., Wu, Y. -. C., Fettiplace, R. The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells. Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).
  12. Moser, T., Beutner, D. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).
  13. Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).
  14. Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish. The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).
  15. Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish. The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).
  16. Griguer, C., Fuchs, P. A. Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick. Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).
  17. Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).
  18. Goutman, J. D., Pyott, S. J. Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti. Methods in Molecular Biology. 1427, 471-485 (2016).
  19. Einarsson, R., et al. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
  20. Fuchs, P. A. Time and intensity coding at the hair cell’s ribbon synapse. The Journal of Physiology. 566, 7-12 (2005).
  21. Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. Hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).
  22. Trapani, J. G., Nicolson, T. Chapter 8 – Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
  23. Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. Physiological recordings from the zebrafish lateral line. Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).
  24. Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
  25. Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM. PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).
  26. Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
  27. Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Chapter 10 – Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).
  28. Sheets, L., et al. Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).
  29. Chou, S. -. W., et al. A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish. Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).
  30. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
  31. . Fiji is just ImageJ Available from: https://fiji.sc/ (2018)
  32. Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).
  33. Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 193, 18-29 (2017).
  34. Fadero, T. C., et al. LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching. Journal of Cell Biology. , (2018).

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Lukasz, D., Kindt, K. S. In Vivo Calcium Imaging of Lateral-line Hair Cells in Larval Zebrafish. J. Vis. Exp. (141), e58794, doi:10.3791/58794 (2018).
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