בתחום ההדמיה סידן Vivo של קו הצד תאים שיער בזחל דג זברה
概要
דג זברה היא מערכת מודל יש תכונות רבות ערך כולל בהירות אופטית, התפתחות חיצוני מהירה,, חשוב במיוחד בתחום השמיעה ושיווי, מבחוץ ממוקם תאי שיער חישה. מאמר זה מתאר כיצד הטרנסגניים דג זברה יכול לשמש כדי assay שיער-תא mechanosensation ותפקוד presynaptic בוססו.
Abstract
תאי חישה שיער הם mechanoreceptors נמצאו באוזן הפנימית הנדרשים עבור השמיעה ושיווי. תאים שיער מופעלות בתגובה לגירויים החישה זה מכנית להסיט את הפסגה בליטות קרא צרורות שיער. סטיה פותח ערוצי mechanotransduction (MET) צרורות שיער, המוביל אל זרם של קטיונים, כולל סידן. זה זרם הקטיון depolarizes התא ופותחת ערוצי סידן ממותגת מתח הממוקם basally presynapse שיער-cell. ביונקים, תאים שיער הם בארגז, זה מאתגר להעריך באופן פונקציונלי פעילויות אלה ויוו. לעומת זאת, דג זברה זחל שקופים והינם בעלי איבר מבחוץ ממוקם לרוחב שורה המכילה תאים שיער. אלו תאים שיער יופי של מבנית דומה בתרבית של תאים שיער, יכול להיות פונקציונלית מוערך ויוו. מאמר זה מתאר שיטה אשר מנצל מחוון סידן מקודדים גנטית (GECI), GCaMP6s, כדי למדוד את הגירוי-עורר סידן אותות בתאים דג זברה לרוחב קו השיער. GCaMP6s ניתן להשתמש, יחד עם הדמיה קונאפוקלית, למדוד אותות סידן ויוו איפקס, בסיס של תאים שיער קו לרוחב. אותות אלה מספקים בזמן אמת, הניתנות לכימות, מפרט. של החלקים שתי פעילויות סידן mechanosensation ותלוי presynapse בתוך התאים האלה שיער. אותות אלה סידן גם לספק מידע פונקציונלי חשוב לגבי כמה תאים שיער לזהות ושידור של גירויים. בסך הכל, טכניקה זו יוצרת נתונים שימושי אודות השינויים בפעילות סידן ויוו. . זה פחות מתאים היטב על כימות של בהירות מוחלטת של סידן שינויים. טכניקה זו אין ויוו רגיש לחפצים תנועה. כמות סבירה של תרגול ומיומנות נדרשים עבור מיקום מתאים, קיבעון, גירוי של הזחלים. בסופו של דבר, כאשר, בביצוע פרוטוקול שתואר במאמר זה מספק דרך רבת עוצמה כדי לאסוף מידע חיוני אודות הפעילות של תאי-שיער במדינות שלהם טבעי, אינטגרטיבי בתוך-חיים.
Introduction
הדמיה תפקודית סידן הוא כלי רב עוצמה שיכול לשמש כדי לפקח על הפעילות של רבים תאים בו זמנית1. בפרט, הדמיית סידן באמצעות מחווני סידן מקודדים גנטית (GECIs) הוכח להיות יתרון כי GECIs יכול להתבטא סוגי תאים ספציפיים לשפות אחרות subcellularly2. במחקר מדעי המוח, תכונות אלה הפכו סידן הדמיה באמצעות GECIs שיטה חזקה כדי להגדיר דפוסי הפעילות בתוך רשתות עצביים והן למדוד זרם סידן הסינפסות בודדים3,4. תוך ניצול תכונות אלה, מחקר שנערך לאחרונה נעשה שימוש מיקרוסקופיה קונפוקלית GECIs כדי לעקוב אחר פעילות subcellular בתוך אוספים של תאים שיער חושי5.
תאים שיער הן mechanoreceptors לזהות גירויים קול ואת שיווי המשקל באוזן הפנימית, תנועת המים המקומי במערכת לרוחב-line6,vetebrates הימית7. תאים שיער לעתים קרובות המטרה של נזק או מוטציות גנטיות שגורמות הצורה הנפוצה ביותר של אובדן שמיעה בבני אדם המכונה שמיעה sensorineural אובדן8,9. לכן, חיוני להבין כיצד אלה התאים פועלים כדי להבין כיצד לטפל ולמנוע אובדן שמיעה. לתפקד כראוי, תאים שיער לנצל שני מבנים מיוחדים הנקראים mechanosensory-שיער חבילות וסרטים סינפטית ויוכל להעביר גירויים, בהתאמה. צרורות שיער ממוקמים השיא של תאים שיער, מורכב בעיקר של בליטות בסדר, שיער כמו המכונה stereocilia (איור 1א’). שיווי המשקל ואת קו הצד תאים שיער, תתי שיער יש גם עם kinocilium ארוך בודד (ריסי האמיתית היחידה של התא), אשר יכול להאריך הרבה מעל stereocilia (איור 1א’). Mechanosensory גירויים להסיט צרורות שיער, סטיה שם המתח על קישורים שנקרא “טיפ-קישורים” המקשרות stereocilia10. המתח הזה פותח ערוצי mechanotransduction (MET) ממוקם stereocilia, וכתוצאה מכך זרם הפסגה של קטיונים, כולל סידן11,12. בסופו של דבר, פעילות זו הפסגה depolarizes תא שיער ופותח ערוצים ממותגת מתח סידן (Cav1.3) בבסיס של התא. Cav1.3 ערוצי נמצאים סמוך לרצועות סינפטית, מבנה presynaptic אשר היתדות שלפוחית-אזורי פעיל. סידן הבזליים זרם דרך Cav1.3 ערוצים נדרשת עבור שלפוחית פיוז’ן, עצבית, והפעלה של נוירונים מביא13,14.
במשך שנים רבות, אלקטרופיזיולוגיות טכניקות כגון תאים כל תיקון מחבר חובק למעקה שימשו כדי לחקור את מאפייני פונקציונלי של תאים שיער במינים רבים, כולל דג זברה15,16,17, 18,19,20. ההקלטות אלקטרופיזיולוגיות היה יקר במיוחד בתחומי השמיעה ושיווי כי הם יכולים לשמש כדי לקבל מדידות מאוד רגישות מתאי החישה בודדים, שמטרתו קידוד גירויים מהיר במיוחד מעל מגוון רחב של תדרים ועוצמות21,22. למרבה הצער, כל תא הקלטות. אי אפשר לאמוד את הפעילות של אוכלוסיות של תאי שיער. ללמוד את הפעילות של אוכלוסיות של תאים לקו לרוחב דג זברה, פוטנציאל microphonic, פוטנציאל פעולה מביא שימשו כדי למדוד את mechanosensitive מסוכם והמאפיינים postsynaptic התגובה של הפרט neuromasts23 ,24. למרבה הצער, לא כל תא הקלטות ולא מדידות פוטנציאליים שדה מקומי יש את הרזולוציה המרחבית לאתר שבו הפעילות מתרחשת בתוך תאים בודדים או למדוד את הפעילות של כל תא בתוך אוכלוסיה. לאחרונה, צבע סידן ו GECIs יש כבר מועסקים כדי לעקוף את אלה אתגרים25,26.
בדג זברה, GECIs הוכיחו להיות בגישה רב-עוצמה לבחינת תפקוד תא שיער בשל הקלות היחסית יצירת דג זברה מהונדס ועל בהירות אופטית הזחלים27. בדג זברה הזחלים, נמצאים תאים שיער באוזן הפנימית, כמו גם מערכת קו הצד. הקו לרוחב מורכב של שושנת עלים דמויי אשכולות של שיער תאים הנקראים neuromasts המשמשים לזהות שינויים המקומיות תנועת המים (איור 1). מערכת קו הצד שימושי במיוחד מאחר שהוא ממוקם באופן חיצוני על פני הדג. גישה זו איפשרה לעורר תאים שיער ולמדוד את אותות סידן שטיחות ב הזחלים ללא פגע. בסך הכל, הקלות של transgenesis, השקיפות של הזחלים, וגישה ללא תחרות של תאים שיער קו הצד הפכו דג זברה מודל לא בפז ללמוד את הפעילות של תאים שיער ויוו. זהו יתרון משמעותי לעומת מערכות יונקים שבו תאים שיער מוקף מבנים גרמי של האוזן הפנימית. חוסר הגישה הפכה קשה מאוד לרכוש פונקציונלי ויוו מדידות של בתרבית של תאים שיער.
פרוטוקול שמפורטות כאן מתאר כיצד לעקוב אחר השינויים ערוץ ותלוי presynapse MET סידן תוך תאים שיער בודדים, בין תאים בתוך neuromasts של דג זברה זחל. פרוטוקול זה מנצל קו הוקמה דג זברה מהונדס המבטא של GCaMP6s מותאמת לשפות אחרות ממברנה תחת השליטה של תאים שיער מסוים myosin6b יזם28. לוקליזציה קרום זה עמדות GCaMP6s כדי לזהות זרם סידן דרך תעלות יונים ממוקם קרום פלזמה קריטית לתפקוד תאי שיער. לדוגמה, GCaMP6s מקומי-ממברנה יכול לזהות סידן זרם דרך MET ערוצי בחבילות שיער הפסגה ודרך CaV1.3 ערוצי ליד סרטי הסינפטית בבסיס של התא. זה מנוגד באמצעות GECIs מקומית של ציטוזול, כפי cytosolic GECIs לזהות אותות סידן הם שילוב של המטרופוליטן CaV1.3 ערוץ פעילות, כמו גם תרומות סידן ממקורות אחרים (למשל, חנות לשחרר). פרוטוקול זה מתאר כיצד לשתק, לשתק את הזחלים הטרנסגניים GCaMP6s לפני הדמיה. אז הוא מתאר כיצד להכין ולהשתמש מטוס נוזל כדי להסיט את צרורות שיער כדי לעורר תאים שיער קו הצד באופן מבוקר לשחזור. נציג נתונים יכולה להיות מושגת באמצעות פרוטוקול זה מוצגים. דוגמאות של נתונים מייצגים תנועה חפצים מוצגים. ניסויים בקרה המשמשים כדי לאמת תוצאות או לא לכלול פריטים מתוארים. לבסוף, מתוארת שיטה להציג באופן חזותי מרחבי סידן אותות בתוכנה פיג’י. ניתוח זה פיג’י היא ממאמרו של שיטות הדמיה שנקבעו קודם פותח באמצעות MATLAB5. בסך הכל, פרוטוקול זה מתווה הכנה עוצמה טכניקה המשתמשת GECIs ב דג זברה זחל כדי למדוד והמחש שיער-תא סידן dynamics ויוו.
Protocol
כל העבודה בעלי חיים אושרה על ידי הוועדה שימוש חיה-מכוני הבריאות הלאומיים תחת פרוטוקול מחקר בבעלי #1362-13. הערה: פרוטוקול זה לוקח כ 0.5-1 h כדי להשלים עם בלי הפרעות, אם פתרונות וציוד מוכן להגדיר מראש. פרוטוקול זה ממוטב Tg(myo6b:GCaMP6s-caax)5,29 הזחלים דג זברה-3 – 7 ימים שלאחר ההפריה (dpf). קו הטרנסגניים זה מבטא GCaMP6s מקומי-ממברנה (דג זברה הממוטבים codon) באופן ספציפי בתאים כל דג זברה שיער. לפני הדמיה, הזחלים גדלים המאגר העובר (E3) תחת תנאים סטנדרטיים. עיין בטבלה של חומרים עבור מספרי קטלוג של כל ציוד ותרופות הדרושים להחלת פרוטוקול זה. 1. הכנת פתרונות להכין 1 מ”ל של α-bungarotoxin (125 µM), אשר משמש כדי לשתק את הזחלים דג זברה במהלך הדמיה תפקודית. להוסיף µL 968.6 של הנדסה גנטית במים סטריליים, µL 33.4 של פנול אדום 1 מ ג של α-bungarotoxin (בקבוק שלם). להפוך 100 µL aliquots ואחסן אותם ב-20 ° C.התראה: יש ללבוש כפפות ולעשות הכנות בשכונה בעת טיפול אבקת α-bungarotoxin. כפפות מומלצים גם בעת טיפול הפתרון α-bungarotoxin. להכין 1 ליטר x 60 העובר מאגר (E3). להוסיף 17.2 גרם של NaCl ו- g 0.76 של אשלגן כלורי אבקת 954.4 מ ל מים הנדסה גנטית. להוסיף הפתרון 19.8 מ של 1 מ’ CaCl2, 19.8 מ של 1 מ’ MgSO4ו- 6 מ של 1 מ’ HEPES מאגר. אחסן את הפתרון 60 x E3 מניות ב 4 ° C עד 6 חודשים. הכינו 10 L 1 x E3 (5 מ מ NaCl 0.17 מ מ אשלגן כלורי CaCl 0.33 מ מ2; MgSO 0.33 מ מ4, pH 7.2), אשר הוא פתרון הזחלים מופצים ב לפני הדמיה תפקודית. להוסיף 167 מ של 60 x E3 פתרון מניות אני 10 ליטר מים הנדסה גנטית כדי להפוך את פתרון x E3 1. אחסן את הפתרון x E3 1 בטמפרטורת החדר (RT) עד 6 חודשים. להכין מאגר עצביים (NB) (140 מ מ NaCl 2 מ מ אשלגן כלורי; מ מ 2 CaCl2; MgCl 1 מ2; 10 מ מ HEPES מאגר, pH 7.3), אשר משמש כדי לטבול הזחלים במהלך הדמיה תפקודית.הערה: 1 x E3 יכול לשמש גם עבור הדמיה תפקודית, אך תגובות הן יותר עמיד ואמין ב- NB. לשלב 28 מ”ל של 5 M NaCl, 2 מ של 1 מ’ אשלגן כלורי, 2 מ של 1 מ’ CaCl2, 1 מ”ל של 1 מ’ MgCl2ו 10 מ ל 1 מ’ HEPES מאגר עם 957 מיליליטר מים הנדסה גנטית. להביא את ה-pH 7.3 עם 1 M NaOH. מסנן לחטא. לאחסן ב 4 ° C עד כחודש.הערה: להביא RT לפני השימוש פתרון. להכין מלאי MS-222 (tricaine, 0.4%), אשר משמש כדי עזים ומתנגד הזחלים. להמיס 400 מ ג של אתיל 3-aminobenzoate methanesulfonate מלח ו- 800 מ ג נה2HPO4 ב 100 מ של מים מזוקקים. להתאים את ה-pH ל 7. חנות ב 4 º C. השתמש 0.04% MS-222 כדי עזים ומתנגד הזחלים במהלך ההזרקה הנייח וα-bungarotoxin. 2. הכנת הדמיה קאמרית וסיכות הכינו את תא הדמיה (איור 2א). למרוח שכבה דקה של גריז סיליקון ואקום גבוה לתחתית התא זלוף לאורך קצות הכיכר אשר דוגלים coverslip. אל תשאיר פערים המשחה. בחוזקה לחץ כלפי מטה מסביב לקצוות של coverslip כדי לאטום אותו לחדר ההדמיה. נגב משם שומן עודף.הערה: מזרק 5 מ עם טיפ micropipette 200 µL מומלץ עבור יישום גריז. הכינו את encapsulant סיליקון כדי למלא את החדר. לערבב יחס של 10:1 (לפי משקל) של בסיס לסוכן ריפוי. מערבבים ביסודיות אבל בעדינות באמצעות טיפ micropipette ליצירת בועות מינימלי. שופכים את encapsulant סיליקון אל coverslip affixed כך שהיא רמה עם פני השטח של התא. כ- 3 גר’ encapsulant ימלא את החדר. בזהירות הקש התא כנגד משטח שטוח והשארתו אופקי, או להשתמש טיפ micropipette (תחת stereomicroscope) כדי להסיר או להוציא בועות לקצה החדר. מקום התא בתנור מעבדה ללון ב- 60-70 מעלות צלזיוס. המקום התא בתוך קופסה מאוורר כדי להבטיח כי אוויר חם לא ישירות נושבת על encapsulant כדי להימנע אדוות. להשתמש מלקחיים בסדר, טונגסטן תילים אופנה הפינים נהגה לשתק הזחלים דרך בראש וזנב (איור 2B1) encapsulant מוקשה. כדי להפוך את ראש סיכות, החזיקו חתיכת מ מ 0.035 טונגסטן תילים ביד אחת תחת stereomicroscope. באמצעות מלקחיים בסדר וביד השנייה, לכופף את החוט 1 מ”מ עד מסוף ב- 90°. להחליף המלקחיים עבור בסדר מספריים וחותכים 1 מ מ לאחר העיקול כדי ליצור את ה-pin. חזור על שלב 2.3.1 באמצעות תיל 0.025 mm כדי להפוך את הזנב סיכות, אבל להשאיר 0.5 מ מ של חוט בצד השני של העיקול. להשתמש מלקחיים כדי להכניס את הסיכות encapsulant מוקשח-התא (עבור אחסון). 3. הכנה של מחטים שיתוק וגירוי להכין מחטים הזרקת הלב באמצעות נימים זכוכית עם נימה. הצמד מחטים טיפ פנימי בקוטר של 3-1 מיקרומטר (איור 2C). להכין מחטים הזרקת נוזל באמצעות נימים זכוכית ללא נימה. משוך מחטים עם טיפ רזה זה יכול להיות שבור עד לקוטר עצה נכונה. לשבור את קצה המחט הזרקת נוזל דק, ארוך על ידי שפשוף זה בניצב נגד עוד מחט הזרקת נוזל או אריח קרמיקה מעל איפה אפשר לכופף את מחט כדי ליצור טיפ פנימי בקוטר של 30 עד 50 מיקרומטר [איור 2C (תמונה אמצעית) ו איור 3 A2]. להבטיח כי מעבר אפילו על פני קצהו (איור 2C, התמונה האמצעית) ולא משוננות או אפילו גדול מדי (איור 2C, תמונה מימין) כדי להבטיח, נוזל מדויק לזרום במהלך גירוי תאים שיער.הערה: מלטש מחט ניתן לתקן את מעברי משוננים. 4. הצמדה ו שיתק זחל על הדמיה קאמרית רחצי זחל Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) כ 1 מ”ל E3 מאגר המכיל 0.04% MS-222 1-2 דקות על פני encapsulant סיליקון לשכת הדמיה עד הזחל הופך משותק או להגיב למגע. תחת stereomicroscope, מקם הזחל במרכז החדר זלוף כך זה שוכב שטוח על צידו מול encapsulant סיליקון.הערה: עקביות, תמיד לטעון הזחלים באותו צד (למשל, בצד ימין למטה, בצד שמאל למעלה) (איור 2B1). בעזרת מלקחיים בסדר, להביא סיכת הראש מ”מ 0.035 למטה בניצב זחל, קאמרית. הוסף את סיכת הראש בין העין לבין שלפוחית otic ולמטה לתוך encapsulant (דמויות 2B1 ו- 2B2). השתמש קבוצה שנייה של מלקחיים כדי לייצב את הזחל לאורך צדו הגבי או הבטני תוך הצמדה. ודא החלק האופקי של ה-pin קשר הזחל לחץ לא כל הדרך לתוך encapsulant. זווית ה-pin ventrally (איור 2B1) או מופנות מעט לכיוון החלק הפנימי. של הדג כדי להימנע מפריעה לב שלאחר מכן הזרקת והדמיה תאים שיער. עם המלקחיים, מכניס סיכה בזנב 0.025 mm מיתר הגב קרוב ככל האפשר עד הסוף של הזנב (איור 2B1).הערה: להיות זהירים כדי למנוע מתיחות הזחל. סיכת הזחל שטוח. העיניים צריך להיות נקודות המגע המוצגים (איור 2B1). זה מאוד חשוב, כדי להקל על הלב הזרקה (איור 2B2-B2′, שלב 5), להקל על מטוס הדמיה רצוי (איור 1B1-B2 ‘, שלבים 8 ו- 9), וכימות את עוצמת הגירוי הזרקת נוזל ( איור 3A3, שלב 7). 5. הזרקה של α-Bungarotoxin לתוך חלל הלב כדי לשתק את הזחל הערה: ללבוש כפפות בעת טיפול α-bungarotoxin. Centrifuge את aliquot α-bungarotoxin בקצרה לפני השימוש כדי למנוע סתימת של המחט הזרקת הלב. מילוי 3 µL של α-bungarotoxin פתרון לתוך מחט ההזרקה הלב באמצעות ג’ל טעינת פיפטה עצה. לטעון את הפתרון באופן שווה הטיפ עם אין בועות. הכנס את המחט הזרקת הלב בעל פיפטה המצורפת micromanipulator ידנית. תחת stereomicroscope, מקם את המחט אז זה מיושר בניצב לציר A-P של הזחלים מוצמדים, מרדימים, כלפי מטה בזווית של ~ 30 מעלות. להתחבר המחזיק פיפטה מזרק לחץ. להחיל את הגדרות המוצע הבאים: Pinjection = 100 hPa, tinjection = 0.5 s, ו- Pcompensation = 5 hPa. להזריק מנת לתוך הפתרון כדי לבדוק אם קצה המחט הוא פטנט. חפשו נשיפה קטנה של הפתרון אדום (בין פנול אדום) לעזוב את קצה המחט. אם אין צבע אדום נתפסת, בעדינות לגרד קצה המחט כנגד הקצה של סיכה ונסה שוב עד המחט היא פטנט. לחלופין, משוך מחט עם פתח טיפ גדול. תוחבים את המחט לכיוון הלב עד שייגע העור מחוץ ללב (איור 2B2). הקש את המחט לתוך הזחל ולחפש כניסה של התא פיגמנט על העור לפני הלב כדי להבטיח את המחט ימוקם במישור הנכון ביחס הזחל (איור 2B2′). לקדם עוד יותר את המחט עד זה קורע את העור ומזין את חלל הלב. משוך את המחט לאחור מעט. להזריק סיילין α-bungarotoxin לתוך חלל הלב. תסתכל על אינפלציה של חלל הלב או על צבע אדום הזנת את החלל. לשטוף בעדינות את הזחל 3 פעמים עם 1 מ”ל של NB להסרת MS שיורית-222. אף פעם לא להסיר את כל הנוזל. לשמור על זחל כ 1 מ”ל של NB-תא זלוף.הערה: להבטיח את הקצב לב זחל זרימת הדם נשארים חזקים לאחר ההזרקה הצמדה והלב וברחבי הדמיה הניסוי כולו. 6. הכנת מיקרוסקופ וההתקנה הזרקת נוזל להרכיב מיקרוסקופ קונפוקלי זקוף באמצעות הרכיבים המתוארות בטבלה של חומרים: מיקרוסקופ קונפוקלי עם 488 ננומטר לייזר, המסננים המתאימים, מיקרוסקופ תוכנה כדי לשלוט ולתאם הדמיה, גירוי, האוויר x 10 המטרה, 60 x מים אובייקטיבי, סורק אובייקטיבית piezo-Z (עבור z-ערימות), המצלמה במהירות גבוהה, מתאם קאמרית מעגלית, מוטורי הבמה, ואת הבמה הוספה מתאם. עיין ג’אנג ואח29 אפשרויות נוספות והדרכה על כיוונוני מיקרוסקופ. להרכיב את jet נוזלים מורכב מ 3 מרכיבים עיקריים: ואקום משאבת לחץ, הלחץ במהירות גבוהה קלאמפ ואת הבמה ראש (גם שמתואר בטבלה של החומרים). השתמש את המלחציים לחץ מהיר כדי לקבוע את תזמון והמשך של הפרשות לחץ או ואקום מחוץ לבמה ראשי ולתוך על פיפטה הזרקת נוזל. לחבר את הפלט של השלב הראשי מחזיק פיפטה הזרקת נוזל דרך צינורות סיליקון עבה. 7. היישור של זחל, הזרקת נוזל הערה: . יש 3 מטוסים של עניין בתוך כל neuromast: (1) קצות השיער חבילות (איור 3A3: kinocilia, המשמש למדידת עוצמת הגירוי); (2) המטוס MET שיער-צרור (איור 1B1-B1′: הבסיס של חבילות שיער הפסגה שבו מזוהים MET-ערוץ-תלויי סידן אותות); (3) המטוס סינפטית (איור 1B2-B2′: איפה סידן presynaptic אותות מאותרים בבסיס של התא שיער). מטוסים אלה מתוארים איור 1א’. µL 10 מילוי של NB לתוך מחט הזרקת נוזל כראוי שבור (מתוך שלב 3.2) באמצעות ג’ל טעינת עצה. לטעון את הפתרון באופן שווה הטיפ עם אין בועות. הכנס את המחט לתוך המחזיק פיפטה המצורפת את micromanipulator ממונע. למקם את התא זלוף מתאם קאמרית מעגלית על הבמה מיקרוסקופ.הערה: עקביות, מקם תמיד הזחל בכיוון זהה (למשל, תא המכיל הזחל עם הישבן שלה וכלפי jet נוזלים הגחוני / צד פונה לכיוון הנסיין). להזיז את הבמה ממונע כך הזחל הוא במרכז שדה הראייה. להפעיל את מתאם קאמרית מעגלי כך הציר A-P של הזחל בערך מיושר עם המסלול של המחט הזרקת נוזל. באמצעות התערבות דיפרנציאלית המוארים המשודרת ניגודיות (DIC), להכניס הזחל המוקד, מרכז זה תחת המטרה 10 x. להעלות את המטרה 10 x. באמצעות את micromanipulator ממונע, להפיל את המחט הזרקת נוזל לתוך המרכז של שדה הראייה כך מואר על ידי האור המשודר, בקושי נוגעת הפתרון NB. . תוריד את המטרה 10 x. מתמקדים הזחל כדי לאשר את מיקומו. . פרדי למצוא את המחט הזרקת נוזל להזיז את המחט הזרקת נוזל עם micromanipulator ב x – ו y – axes עד שהוא יהיה במיקום מקביל בצד הגבי של הדג. להתמקד בחזרה על הזחל. להפיל את המחט בתוך ציר z. מקם את המחט לאורך הצד הגבי של דגים ושל ~ 1 מ”מ, והגוף (איור 3A1). הזז בזהירות את מתאם קאמרית מעגלית (במקרה הצורך) על מנת להבטיח כי המחט הזרקת נוזל מיושר לאורך קו האמצע A-P של הזחל (איור 3A1). הזז את הבמה ממונע כדי למקם את neuromast עניין במרכז שדה הראייה. שמור על קצה המחט הזרקת נוזל לאורך הצד הגבי של הדג. אל תגעו קצה המחט הזרקת נוזל הזחל או על פני החדר. לעבור 60 x מים אובייקטיבי. ודא כי המטרה הוא שקוע הפתרון NB. שימוש המוקד בסדר כדי לאתר של neuromast באמצעות ששודרו אור ואופטיקה DIC.הערה: תוכנית התקנה זו נועדה לעורר neuromasts לאורך הקו הראשי לרוחב האחורי. תאים שיער בתוך neuromasts אלה להגיב הקדמיים או האחוריים או זרימה נוזלים מכוונת. ראה et al. צ’ו31 עבור מפה מדויקת של הרגישות נוזל neuromast בתוך מערכת קו הצד. מקם את המחט הזרקת נוזל עם micromanipulator כך שהוא 100 מיקרומטר מהקצה החיצוני של neuromast (איור 3A2).הערה: בחר neuromasts נשקף נוף ברור מלמעלה-למטה (דמויות 1B1′-B2′ ואיור 3A3) במקום תצוגות זווית צד (איור 1C1-C2). תצוגה ברורה מלמעלה מאפשר הדמיה של צרורות שיער הפסגה כל מטוס אופטי יחיד בו זמנית או הדמיה של סינפטית באזורים פחות מטוסי אופטיים (איור 3A3). פוקוס עד קצות השיער הפסגה-חבילות (kinocilia) (איור 1א’, דמויות 3A2 ו- 3A3). החלק התחתון של המחט הזרקת נוזל צריך להיות בפוקוס במטוס הזה. הגדר את המלחציים לחץ במהירות גבוהה מהמדריך מצב חיצוני כדי לקבל קלט בתוכנת הדמיה. אפס את המלחציים לחץ במהירות גבוהה על ידי לחיצה על כפתור ה-“0”. השתמש את כפתור שנקבעה מראש-כדי להגדיר את מנוחתו הלחץ מעט חיובי (~ 2 מ מ כספית). לאשר את הפלט מנוחתו של המלחציים לחץ מהיר באמצעות manometer של PSI המחובר לפלט הבמה ראש.הערה: הגדר בלחץ חיובי מעט מנוחה כדי למנוע את ספיגת הדרגתית של נוזל לתוך המחט הזרקת נוזל לאורך זמן. אם נוזל מזין לאורך צינור המחובר אל המטוס הנוזל מגיע השלב הראשי, זה עלול לגרום נזק לציוד. לקבוע את הלחץ הדרוש כדי לגרות את צרורות שיער. השתמש 0.125 ו 0.25 V קלט (6.25 ו- 12.5 מ מ כספית) עבור 200-500 ms כדי להחיל מבחן גירוי (איור 3A3-A3 ‘).הערה: המלחציים לחץ מהיר ממיר מתח קלט (מתוך התוכנה או התקנים אחרים המתחברים ליציאה BNC ביציאה הפקודה קלאמפ לחץ מהיר) לתוך לחץ משוחרר מן השלב הראשי, ולבסוף, את המחט הזרקת נוזל (1.0 V = 50 מ מ כספית, בעוד-1.0 V =-50 מ מ כספית). בתצורה זו (ראה צעד 7.2) חיובי לחץ (דחיפה) חורג צרורות שיער לקראת הקדמי, ואת לחץ שלילי (משיכה) חורג צרורות שיער לכיוון האחורי. באמצעות האור המשודר DIC אופטיקה יחד עם סרגל קנה מידה, למדוד את המרחק הטיה על ידי הגירויים 6.25 ו- 12.5 מ מ כספית של קצות השיער חבילות, kinocilia (איור 1א’ , דמויות 3A3-3 ‘). לבחור לחץ שזז חבילות (כמו 1 יחידה מלוכדת) מרחק של 5 מיקרומטר (איור 3A3 ‘). ודא כי קצות kinocilia להישאר בפוקוס כל הזמן. הזז את הזרקת נוזל ± 25 מיקרומטר לאורך הציר A-P של הזחל למצוא מרחק לחץ ומעכבת את קצות kinocilia 5 מיקרומטר.הערה: באמצעות GCaMP6s הזחלים dpf 3 – 7, 5 מיקרומטר אפשרות סטיה להשגת ליד קולח GCaMP6s סידן אותות ונזק צריך לא שיער הפסגה-bundle מבנים (איור 3A3 ‘). מרחקים תזוזה קטנה יותר יכול לשמש כדי לספק גירויים שאינם קולח (איור 3A3’). הזחה מרחקים > 10 מיקרומטר שקשה להעריך ( איור 3A3 ‘ ‘) יכול להזיק לאורך זמן. האות רוויה הוא תלוי גיל neuromast (וגובה kinocilial) כמו גם המחוון בשימוש. בדוק patency של המחט הזרקת נוזל לכל כיוון (לחץ/לדחוף, ואקום/pull) מעת לעת במהלך דימות. מחטים הזרקת נוזל הסותמים בקלות ולאבד patency ואקום, אך הם שומרים על לחץ שיורית patency. השתמש DIC אופטיקה גירוי מבחן קצר לכל כיוון כדי לבדוק אם הזרקת נוזל patency. למקד את הדגימה לתוך המטוס עניין (למשל, הבסיס של חבילות הפסגה שיער או הבסיס של התא שיער במישור סינפטית; איור 1 B1-B2′). 8. אפשרות הליך רכישת הדמיה 1: רכישת מטוס יחיד הערה: כל הדמיה המתוארות ב פרוטוקול זה כרוך בנטילת RT. הגדר imaging התוכנה לרכוש רכישת 80-מסגרת של זרימה או רציף עם לכידה כל 100 ms כדי להשיג קצב 10 הרץ. להגדיר רווח, צמצם וכוח לייזר כדי למטב את אות הזיהוי, אלא למנוע רוויה, photobleaching ורעש. הגדרות לדוגמה Opterra/SFC הם כדלקמן: 488 ננומטר לייזר כוח: 50 (שיער-צרור MET המטוס), 75 (מישור סינפטית); שסע מיקרומטר 35; רווח = 2.7; EM רווח = 3900.הערה: חלות 2 X binning אם אותות חלשים או רועש מדי או בעלי photobleaching מוגזמת. 2 X binning רצון לשפר את אות הזיהוי במחיר של רזולוציה מרחבית. בחר גירוי למסור במהלך 80-המסגרת (8 s) רכישה לאחר מסגרת 30, 3 s.הערה: כמה גירויים בדוגמה להלן: 200 ms (+ או – 0.25 V) עד 2 s (+ או – 0.25 V) צעד בכיוון או האחוריים כדי לזהות את הרגישות כיוונית של כל תא שיער; 2 s, גל מרובע 5 הרץ (0.25 V עבור 200 ms,-0.25 V עבור 200 ms, חוזר על עצמו 5 פעמים) כדי לעורר כל השיער תאים בו זמנית. לחץ חיובי (גירוי הקדמי) יהיה להפעיל את מחצית תאי השיער. לחץ שלילי (גירוי האחורי) יהיה להפעיל השני מחצית תאי השיער. ודא שהתוכנה גירוי או התקן מחזיר את המלחציים לחץ בחזרה ל- 0 V בסיום הגירוי. למדוד mechanosensitive סידן תגובות. להתמקד על הבסיס של חבילות שיער הפסגה (דמויות 1A ו- 1B1-B1′) ולהתחיל ייבוא תמונות.הערה: אם neuromast מוצג בבירור מלמעלה למטה (איור 1B1-B1′), צרורות שיער הפסגה כל יכול לדימות בו-זמנית במטוס בודד. למדוד סידן presynaptic תגובות. המוקד לבסיס של תאי השיער (דמויות 1A ו- 1B2-B2′) ולהתחיל ייבוא תמונות.הערה: אם neuromast מוצג בבירור מלמעלה למטה (איור 1B2-B2’), המטוסים הדמיה presynaptic של כל התאים שיער ניתן לרכוש ב- 2-3 מטוסים סט 2 מיקרומטר לגזרים. Tg [myo6b:ribeye-mcherry] דגים הטרנסגניים יכול לשמש כדי לזהות ולאתר סרטים presynaptic ואתרים של סידן ערך29. 9. אפשרות הליך רכישת הדמיה 2: רכישת מטוס רב לכוון את אלמנט פייזו-Z המצורפת המטרה 60 x לרכישות מהיר (ms 12-18). ודא כי הגדרות מהירות מקס שנבחרו. צור רכישת Z-מחסנית באמצעות אלמנט פייזו-Z. רוכשים הפעילות MET שיער-צרור במישורים 5 שלב בגודל של 0.5 מיקרומטר. ידרשו את אותות presynaptic במישורים 5 שלב בגודל של 1 מיקרומטר. הגדר את קצב המסגרות 10 הרץ. כל אחת מהמסגרות יהיה ללכוד כל 20 ms ובצורה כל Z-ערימה כל 100 ms. להגדיר את הרכישה עבור מסגרות 400 או Z-במחסן 80 ב-10 הרץ עבור 8 s הזרמת רכישה. הגדר עוצמת הלייזר, צמצם, רווח כדי למטב את אות הזיהוי, אלא למנוע רוויה, photobleaching ורעש. הגדרות לדוגמה עבור מערכת Opterra/SFC הם כדלקמן: 488 ננומטר לייזר כוח: 75 (שיער-צרור MET המטוס), 125 (מישור סינפטית); שסע מיקרומטר 35; רווח = 2.7; EM רווח = 3900.הערה: החלת 2 X binning אם אותות חלשים מדי,רועש, או photobleaching יתר. 2 X binning רצון לשפר את אות הזיהוי במחיר של רזולוציה מרחבית. בחר גירוי למסור במהלך רכישת החל מ- מסגרת 150, לאחר 3 s. להמשיך את הפרוטוקול כפי שמתואר לעיל עבור רכישת מטוס בודד, אך מרכז הערימה-Z המטוסים הפסגה או הבזליים (שלבים 8.4 ו- 8.5). 10. שליטה: בלוק תרופתי של סידן עורר כל אותות הערה: BAPTA (1, 2-bis(o-aminophenoxy) אתאן-N, N, N′, חומצה N′-tetraacetic) הטיפול הוא פקד קריטית בעת קודם יצירת פרוטוקול זה. לאחר השלמת השלבים 8 או 9, החלף את NB 1 מ”ל של NB המכיל 5 מ מ BAPTA כדי לבקע את הקישורים עצה נדרש לשער הפסגה ערוצי MET ממוקם צרורות שיער. תקופת דגירה של 10 – 20 דקות ב- RT. לשטוף BAPTA 3 פעמים עם 1 מ”ל של NB. חזור על שלב 8 או 9. לאחר טיפול BAPTA, צריך להיות שינוי. זריחה GCaMP6s בתגובה הזרקת נוזל גירוי צרורות שיער הפסגה או המטוס סינפטית. אם שינויים GCaMP6s זריחה נמשכות, אלה אינם אותות סידן נכון, ייתכן תנועה חפצים. 11. שליטה: בלוק תרופתי של סידן Presynaptic אותות (אופציונלי) לאחר השלמת השלבים 8 או 9, החלף את NB NB המכיל isradipine 10 מיקרומטר עם 0.1% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) כדי לחסום את הערוצים סידן מסוג L-presynapse שיער-תא. תקופת דגירה של 10 דקות ב- RT. מבלי לבצע שטיפה, חזור על שלב 8 או 9. לאחר הטיפול, עדיין צריכות להיות שינויים זריחה GCaMP6s בתגובה לגירוי הזרקת נוזל צרורות שיער הפסגה, אבל לא את המטוס סינפטית. אם שינויים GCaMP6s זריחה נמשכות במטוס סינפטית, אלה אינם אותות סידן נכון, ייתכן תנועה חפצים. 12. תמונה, עיבוד גרפית ייצוג נתונים הערה: השתמש פיג’י (שלבים 12.1 – 12.1.5) ותוכנית graphing (שלבים 12.2 – 12.2.3) עבור שלב 12. StackReg, TurboReg (שלב 12.1.3), זמן סדרה מנתח V3 (צעדים 12.1.4–12.1.6), פיג’י תוספים גם הם נדרשים (ראה טבלה של חומרים). פתח רצף תמונות בפיג’י, סדרת יחיד-מישור הזמן (מישור יחיד 80-מסגרת) או סדרת Z-מחסנית זמן (400-מסגרת רב מישור). לחץ על “קובץ”, בחר “יבא” מתוך התפריט הנפתח ולחץ על ‘רצף תמונות’. עבור סדרה פעמים Z-מחסנית, Z-פרוייקט בכל פעם הצבע (5 מטוסים לכל timepoint) כדי ליצור רצף תמונות 80-מסגרת. לחץ על ‘תמונה’, בחר “אוספים” מתוך התפריט הנפתח בחר “כלים” מתוך התפריט הנפתח, לחץ על “Grouped Z-פרויקט.” בחר “בעוצמה ממוצעת” שיטת הקרנה והזן “5” עבור “גודל הקבוצה”.הערה: ניתן לנתח כל מטוס בתוך הערימה Z בנפרד לפרטים נוספים מרחבי. הסר 1 הראשון s (10 מסגרות) מ- 8 s (מסגרות 80) של ייבוא תמונות. לחץ על ‘תמונה’, בחר “אוספים” מתוך התפריט הנפתח בחר “כלים” מתוך התפריט הנפתח, לחץ על “להפוך Substack.” הזן “11-80” עבור “פרוסות”.הערה: Substack הזה יכונו בשם stk1. רשום את רצף תמונות (stk1) באמצעות תוסף של StackReg32. לחץ על “תוספים”, בחר “StackReg” ובחר “תרגום” כמו שיטת הרישום עבור סדרת 70-מסגרת הזמן.הערה: זה substack רשום יכונו בשם stk2. להשתמש תוסף פעמים סדרה מנתח V3 כדי לחלץ את המידות בעוצמה (נ) GCaMP6. במקום אזור בעל עניין (ROI) על צרורות שיער הפסגה או אתרים presynaptic stk2. להפנות אל אתר ImageJ (ראה טבלה של חומרים עבור הקישור) לקבלת הוראות כיצד להשתמש זמן סדרה מנתח V3.הערה: השתמש של מעגלי 1 – 2 מיקרומטר ROI עבור צרורות שיער הפסגה ומיקרומטר 5-3 מעגלי רועי למטוס סינפטית (דמויות 4A1 ו- 4A2). בחר את הפרמטרים מדידה. לחץ על ‘נתח’, בחר ‘ “מדידה להגדיר”, ‘ להבטיח כי רק “מתכוון ערך האפור” נבחרה. במנהל רועי, בחר ROIs כל ולהשתמש בפונקציה מידה מרובה כדי ליצור ערכי העוצמה (נ) עבור כל רועי בסדרה זמן. בתוך רועי מנהל, לחץ על “יותר >>” ובחר “ריבוי אמצעי” מתוך התפריט הנפתח. להתוות ערכים (נ). להדביק את הערכים (נ) את התוצאות “ריבוי אמצעי” תוכנה graphing כדי ליצור גרף של X-Y (דמויות 4A1 “והוא 4A2”).הערה: צור (X) ערכים באופן ידני או להשתמש חותמת הזמן של המטה-נתונים. לכמת את התוכנית הבסיסית (Fo) עבור כל רועי על ידי חישוב ממוצע ערכי (נ) בתוכנית graphing ממסגרות קדם גירוי 1 – 20. עבור כל רועי, להחסיר את (Fo) מתוך הערכים (נ)-כל timepoint ליצירת ערכים ΔF (F-Fo). Replot, אם רצונך בכך. לחשב, עלילה ΔF/Fo. עבור כל רועי, לחלק את ΔF מדידה על ידי (Fo) ואת replot (4A1 דמויות ‘ , 4A2 ‘). 13. תמונה עיבוד וייצוג מפה חום של אותות סידן-עתיים הערה: עבודה קודמות ליצירת חום מרחבי ייצוג מפה של סידן אותות בדג זברה תאים שיער קו הצד השתמשו תוכנות מותאמות אישית בכתב ב- Matlab5,28. ניתוח זה הותאם עבור תוכנת ניתוח פתוח פיג’י33. השתמש פיג’י עבור כל השלבים המתוארים להלן. תוספים StackReg לבין פיג’י TurboReg גם הם נדרשים (ראה טבלה של חומרים). בצע שלבים 12.1 – 12.1.3 עבור כל Z-מחסנית או מטוס בודד סדרת זמן ליצור את substack רשום המכונה stk2. השתמש stk2 כדי ליצור תמונה בסיסית. לחץ על ‘תמונה’, בחר “אוספים” מתוך התפריט הנפתח ובחר “פרויקט Z”. בחר “בעוצמה ממוצעת” עבור “סוג ההקרנה” והזן “1” על “התחל slice” ו- “20” עבור “Stop slice”.הערה: Z-התחזית הזאת יכונו בשם baselineIMG. Bin חנותם של רצף תמונות (נ) 70-מסגרת (stk2) לתוך פחי 0.5-s 14. לחץ על ‘תמונה’, בחר “אוספים” מתוך התפריט הנפתח בחר “כלים” מתוך התפריט הנפתח, לחץ על “פרויקט Z מקובצים”. בחר “בעוצמה ממוצעת” “שיטת הקרנה”, והזן 5 עבור גודל הקבוצה”.”הערה: Z-התחזית מקובצים הזאת יכונו כמו stk2bin ו- F באיור5. להחסיר את ערך הפיקסל של נתוני בסיס (baselineIMG) מהרצף נשברתי (נ) תמונה (stk2bin) כדי ליצור רצף תמונות ΔF. לחץ על “תהליך” ובחר “מחשבון תמונה” מתוך התפריט הנפתח. בחר stk2bin כמו “Image1”, baselineIMG “Image2.” בחר “חיסור” עבור “פעולה”.הערה: המופחת בסיסית Z-התחזית הזאת נקראת stk2binBL ו- F-BL = ΔF באיור5. בחר טבלת בדיקת מידע (LUT) של בחירה כדי להציג רצף תמונות ΔF (stk2binBL). לחץ על ‘תמונה’, בחר “טבלאות בדיקת מידע” מתוך התפריט הנפתח ולחץ על פבואר של בחירה.הערה: “אדום חם” הוא LUT להשתמש באיור5. המופחת בסיסית Z-התחזית הזאת עם LUT נחשבת stk2binBL-LUT וΔF LUT באיור5. הגדר את מינימום (דקות) ואת ערכי הבהירות (מרבית) המרבי עבור stk2binBL-פבואר. לחץ על ‘תמונה’, בחר ‘התאם’ ולחץ על ‘בהירות/ניגוד’. להגדיר את ערך מינימום כדי להסיר רעש רקע stk2binBL-פבואר. הגדר את ערכי מקסימום כדי לשמור על אותות עניין אלא למנוע אות רוויה [למשל, 200 ל 1600 (תמונה 12 סיביות בעוצמה טווח = 0 כדי 4095)].הערה: להשתמש באותם ערכים min ו- max בעת ביצוע השוואות חזותי או ייצוגי. ניתן להפיק ΔF כיול LUT בר בפיג’י עבור כל רצף תמונות LUT (למשל, stk2binBL-LUT). לחץ על ‘נתח’, בחר “כלים” ולחץ על “כיול בר”. בטל את “כיסוי” כדי ליצור תמונה נפרדים, בודדים עם הבר כיול LUT לעיון. להמיר בשתי ΔF (stk2binBL-LUT)עם הדימוי הרצוי LUTand חנותם נשברתי (נ) (stk2bin) רצפים ל- RGB. לחץ על ‘תמונה’, בחר ‘סוג’, ולחץ על “צבע RGB.”הערה: המרה-RGB Z-ההקרנות יכונו stk2binBL-LUT-RGB ו stk2bin-RGB, בהתאמה. כיסוי הדימויים LUT ΔF (stk2binBL-LUT-RGB) על גבי (נ) נשברתי תמונות (stk2bin-RGB). לחץ על “תהליך” ולאחר מכן “תמונת מחשבון”. בחר stk2bin-RGB Image1 ו- stk2binBL-LUT-RGB כמו Image2. לבחור “שקופות-אפס” עבור “פעולה”.הערה: אם יש יותר מדי רעש או רקע בכיסוי LUT ΔF, חזור על שלב 13.3 כדי להגדיל את הערך min. אם יש רוויה, חזור על שלב 13.3 ולהגדיל את הערך המרבי. 14. תמונה עיבוד ועתיים חום מפה ייצוג באמצעות מאקרו פיג ‘ י הערה: הסעיף הבא מתייחס מאקרו פיג’י שנקרא LUToverlay מבוסס על שלב 13 אשר תיצור באופן אוטומטי מפת החום מרחבי ייצוג אותות GCaMP6s. ניתוח זה דורש פיג’י33 תוכנת ניתוח פתוח של תוספים StackReg ו- TurboReg פיג’י (ראה טבלה של חומרים). הורד את המאקרו כיסוי LUT פיג’י (LUToverlay.ijm) המלווה פרוטוקול זה (ראה קובץ קידוד משלימה). לפתוח סדרת זמן רב מטוס או סדרת יחיד-מישור הזמן (ראה שלב 12.1). לחץ על “תוספים”, בחר “מאקרו”, לחץ על “הפעלה”, בחר את המאקרו LUToverlay. תיבת דו-שיח תופיע עם הטקסט, “ספר לי על ייבוא תמונות שלך”.הערה: עבור תיבת הדו-שיח, המספרים הנוכחי הם ערכים המוצע, והוא ניתן לשינוי בהתאם לכיוונון בשימוש על ידי הנסיין. הערכים המפורטים בתיבה, להלן מוגדרים עבור סדרה זמן רב מטוס עם 400 תמונות ומטוסים 5 לכל timepoint (שלב 9). לאחר “מספר מטוסים לכל timepoint”, הזן את מספר מטוסים לכל timepoint (למשל, עבור שלב 12.1.1 באמצעות מטוס רב סדרה 400 פעם עם מטוסים 5 לכל timepoint, הזן “5”). רכישת מטוס בודד (למשל, שלב 8) נכנסים “1”.הערה: בתיבות הדו-שיח הנותרות, לסדרת זמן רב מטוס, “Timepoints” מתייחס לתמונות מספר בערימה-Z המתוכננת (למשל, עבור שלב 12.1.1 זה 80 timepoints). השתמש באפשרות “להגדיר את הטווח כדי לנתח” כדי להסיר את 1 הראשון s של רצף תמונות (למשל, עבור שלב 12.1.2 בחר “11-‘ 80” כדי להסיר את המסגרות הראשון 10 ו- 1 הראשון s). אחרי “להגדיר timepoints בסיסית”, הזן את מספר תמונות כדי לשמש כדי ליצור את התמונה הבסיסית [למשל, עבור שלב 13.2., “20” הזן כדי להשתמש בתמונות גירוי מקדים (11-30)]. לאחר “Timepoints לכל סל טמפורלית” הזן מספר תמונות כדי bin עבור הכיסוי. (למשל, עבור שלב 13.2.2. בחר “5” כדי ליצור פחי 0.5-s 14). אחרי “דקות בעוצמה” ועוצמה “מקס” הזן את ערכי המינימום והמקסימום בהירות להסיר את רעשי הרקע (מינימום), שומרים על אותות עניין תוך הימנעות רוויה (לכל היותר). לאחר “בחר טבלת בדיקת מידע”, בחר את LUT הרצויים עבור הכיסוי. לחץ על “אישור”.הערה: המאקרו יסיים לנתח את התמונות לפי ההוראות הציגה בשלב 13. תמונות שנוצרו על-ידי המאקרו תיקרא גם לפי ההוראות בשלב 13. סגור את כל החלונות ניתוח לפני עיבוד רצף תמונות חדשות.
Representative Results
לאחר myo6b:GCaMP6s-דגים הטרנסגניים caax כראוי קיבוע ואת הגירוי הזרקת נוזל מועבר לתאים לרוחב קו השיער, אותות חזקים סידן ניתן לאבחן וכן נמדד (איורים 4 , 5, שצולמו 2 X binning). במהלך גירוי הזרקת נוזל, אותות סידן ניתן גם למדוד את צרורות שיער הפסגה, שבו ערוצי MET לפתוח בתגובה לגירויים או בבסיס של תאים שיער, איפה לעורר presynaptic Cav1.3 סידן ערוצי עצבית. דוגמה ייצוגית של סידן תגובות באזורים אלה עם neuromast בודדים מוצגים באיור4A1-A2 “. בדוגמה זו, 2-s 5 הרץ הזרקת נוזל גירוי נמסרה כדי להפעיל את כל התאים שיער בתוך neuromast נציג. במהלך הגירוי, אותות חזקים סידן ניתן להבחין בחבילות שיער (איור 4A1-A1 ‘, של קבוצות שער 8 תגובות מוצגים). מערכת זו, כמעט כל התאים שיער בוגרים להציג את זרם הפסגה של סידן5. לעומת זאת, בתוך neuromast אותו, יש סידן לגילוי אותות במישור הבזליים, סינפטית רק ערכת משנה (~ 30%) של תאים שיער (איור 4A2-A2 ‘, 4 תאים עם תגובות presynaptic מוצגים)5. 4 ירוק ROIs הצג תאים עם אין אותות משמעותי סידן presynaptic (איור 4A2-A2 “) למרות אותות חזקים סידן הפסגה (איור 4A1-A1 ‘). בדוגמה זו נציג (איור 4A1-A2 ‘), צבע ROIs משתווה צרורות שיער במישור MET הפסגה (איור 4A1) עם גופם תא במטוס סינפטית הבזליים (איור 4A2). דוגמה זו מדגיש ניתן למדוד איך שני אותות תלויי – ו presynaptic-סידן MET בתוך תאים שיער בודדים והן בקרב אוכלוסיות של תאי שיער. ניתן להתוות את האותות סידן שתי חבילות שיער ו presynapse את בצורה גרפית raw GCaMP6s (נ) בעוצמה או ΔF/Fo GCaMP6s בעוצמה (ראה שלב 12, דמויות 4A1’-A1 ‘ , 4A2′-A2 “). הגרפים GaMP6s (נ) להדגיש עוצמת קרינה פלואורסצנטית בסיסית עבור כל תא יכול להיות שונה (דמויות 4A1′ , 4A2’). בגרפיםo GCaMP6s ΔF/F, כל תא הוא מנורמל לערכו הבסיסית ואת השינוי שהבוטות היחסית מקו מותווים (דמויות 4A1 ‘ , 4A2 ‘). בשני (נ), ΔF/Fo GCaMP6s מגרשים, האותות סידן צרור שיער הפסגה והן הבזליים המטוס presynaptic ליזום עם תחילתה של הגירוי (תיבת אפור), ירידה אקספוננציאלית אחרי הגירוי. במהלך הגירוי, סידן אותות בחבילות שיער מתנשאים בתלילות, עיתוני אם הכוח של הסטה לא משנה (איור 4A1-A1 ‘). לעומת זאת, בתוך תת המערכת של תאים שיער עם סידן לזיהוי האותות בתוך המטוס סינפטית, האותות סידן להגביר הדרגתי יותר, נוטים פחות רוויה (איור 4A2-A2 ‘). תאים שיער ללא סידן presynaptic אותות (ROIs ירוק), האותות סידן נשארות בקרבת הבסיס. בנוסף ייצוגים גרפיים אלה (איור 4), סידן אותות להיות visualized במרחב בתוך neuromast כולה במהלך הזמן ההקלטה. דוגמה של ייצוג ייתכן מוצג באיור 5 עבור אותות GCaMP6s presynaptic במישור הבזליים של neuromast. איור 5, השלבים העיקריים לעבד רצף תמונות להמחשת המרחבי מתוארים כפי שמתואר בשלב 13. ראשית, תמונות raw GCaMP6s (נ) חנותם מנופה [איור 5: שורה 1 (5 של הארגזים 14 מוצגים); שלב 13.2.1]. ואז, התמונה הבסיסית, מחושב ממסגרות קדם הגירוי (שלב 13.2), יופחת מ האותות קרינה פלואורסצנטית (נ) GCaMP6s כדי לקבל תמונות ΔF (איור 5: שורה 2; שלב 13.2.2). בשלב הבא, תמונות בגווני אפור ΔF יומרו לצבע LUT (איור 5: שורה 3, אדום חם LUT; שלב 13.3). לבסוף, הדימויים ΔF בהמרה LUT הערוכים בשכבות על גבי חנותם נשברתי תמונות (נ) (איור 5, שורה ראשונה) כדי לחשוף את האותות ייתכן בתוך neuromast במהלך גירוי (איור 5: שורה 4; שלב 13.4). מפות חום של ΔF GCaMP6s אותות לספק הן יכולות מידע חשוב לא קל לנתח את ROIs יחיד, הגרפים המשמשים באיור 4. מפות חום יכול לעזור להמחיש מידע ייתכן חיוני, לרבות מידע subcellular הופעת ומשך הזמן של סידן אותות בתוך כל תא שיער, כמו גם את התזמון והעוצמה ההבדלים בין תאים שיער בתוך כולו neuromast. חשוב לוודא גרפים ומפות חום המרחבי מייצגים אותות אמת סידן אינם חפצים חיישן תנועה. פרוטוקול זה, חפצים תנועה יכולה להיות התוצאה של סחיפה מוגזמת או תנועה של זחל או תנועה עקב גירוי הזרקת נוזל. מכל לכלוכים אלה מאתגרת כדי לסלק בהכנה ויוו הזה. בזמן רישום של רצפי תמונות (שלב 12.1.3) ניתן לתקן עבור הרוב המכריע של התנועה ב x – ו y-axes, רצפי תמונות עם תנועה מוגזמת ציר z חייב להיות ולהסרה מניתוחי. תנועה חפצים הם הקלה לזיהוי על-ידי יצירת גרפים את האותות סידן. דוגמאות לשינויים בעוצמה GCaMP6s הם חפצים ואינם אותות GCaMP6s נכון יכול להיות שנצפו על השיא (איור 4B1’-B1 ‘) ואת הבסיס (איור 4C1’-C1 ‘) של תאים שיער. בחבילות שיער הפסגה, תנועה ממצאים שכיחים כאשר הגירוי הזרקת נוזל חזק מדי (איור 3A3 ‘ ‘). במהלך גירוי חזק בצורה מוגזמת, המטוס שיער הפסגה-צרור יכול להזיז בפוקוס במהלך גירוי הזרקת נוזל ואז לחזור המטוס מוקד המקורי לאחר הגירוי מסתיימת (איור 4B1′-ב’ ‘). דבר זה הופך קשה למדוד במדויק את הפסגה MET תלויי סידן אותות. דוגמה של שיער-צרור תנועה חפצים ניתן לראות באיור4B1’-B1 ‘. . הנה, הגרפים מראים ירידה GCaMP6s אותות במהלך הגירוי (תיבת אפור) כאשר השיער חבילות הם out-of-להתמקד. לאחר הגירוי מסתיימת, אותות GCaMP6s להגדיל במהירות צרורות שיער לחזור למיקום המקורי שלהם, לחזור להתמקד. זה מנוגד הדוגמה באיור4A1’-A1 ” בו האותות סידן הפסגה להגדיל מיד עם תחילת הגירוי או להקטין את הגירוי מסתיים. בזמן תנועה עקב עודף גירויים הזרקת נוזל באפשרותך גם להזיז את המטוס סינפטית מחוץ לפוקוס, סוג זה של החפץ תנועה היא פחות נפוצה במטוס הזה. במקום זאת, שינויים בפוקוס על ציר z עקב תנועה או סחיפה של הזחל הם הסיבות הנפוצות ביותר של תנועה חפצים. הזחל תנועה או להיסחף יכול להשפיע על מדידות GCaMP6s-איפקס והן הבסיס של תאים שיער. דוגמה של תנועה זחל זה מגביר GCaMP6s במישור הבזליים, סינפטית במהלך הגירוי מוצג באיור4ג ‘-C ‘. תנועה חפצים (איור 4C1’-C1 ‘) ניתן להבחין בין אמת אותות presynaptic (איור 4A2′-A2 “) על ידי בחינת מסלול הזמן של האותות GCaMP6s. במקום ולהקטנה אקספוננציאלית עם הגירוי (איור 4A2’-A2 ‘), תנועה-induced העלאות GCaMP6s אות יש ריבוע הצורה ואת עלייתה ונפילתה בפתאומיות עם תחילת, קיזוז של הגירוי, בהתאמה ( איור 4 C1’-C1 ‘). בנוסף בחינה זהירה של מסלול הזמן של אותות GCaMP6s, בקרת ניסויים באמצעות פרמקולוגיה יכול לשמש כדי להבדיל אותות GCaMP6s נכון תנועה חפצים. לדוגמה, ניתן להחיל BAPTA (שלב 10) כדי לדבוק העצה-הקישורים הנדרשים לתפקוד MET-ערוץ בחבילות שיער. BAPTA אמור לחסל גם נוזל-סילון-עורר זרם סידן תלויות-MET-ערוץ הפסגה, כמו גם זרם הבאים סידן הבזליים, presynaptic באמצעות Cav1.3 ערוצים. בדוגמה נציג של סידן עורר גירוי אמיתי אותות (איור 4A1-A2 “) במהלך גירוי הזרקת נוזל, כל השינויים בזריחה GCaMP6s שני המטוסים הפסגה, הבסיס להימחק לאחר טיפול BAPTA. לעומת זאת, שינויים GCaMP6s זריחה חיישן תנועה כמו אלה המוצגים דמויות 4B1’-B1 ‘ , 4 C 1’-C1 ‘ לא להיות מסולקים על ידי טיפול BAPTA. בנוסף לשימוש BAPTA לחסל את כל הסימנים GCaMP6s עורר-גירוי, יכול להיות מיושם isradipine (שלב 11) במיוחד לחסום Cav1.3 תלויי סידן זרם בתוך המטוס סינפטית הבזליים תוך השארת הפסגה MET-ערוץ-תלויי סידן זרם שלם5. לאחר היישום של isradipine, ב neuromast בודדים בחפצים ללא תנועה, שינויים GCaMP6s זריחה בחבילות שיער הפסגה (איור 4A1’-A1 ‘) במהלך גירוי הזרקת נוזל יהיה שהודעה, בעוד כל GCaMP6s סינפטית קרינה פלואורסצנטית שינויים בבסיס להימחק (איור 4A2’-A2 ‘). כל שינוי אות GCaMP6s במטוס סינפטית לאחר יישום isradipine (למשל,איור 4C1-C1 ‘) קרוב לוודאי מקבילים תנועה חפצים. איור 1 : מבט כולל על neuromast של קו הצד ומטוסים הדמיה תפקודית. (א) בדיאגרמה משמאל מציג צד-תצוגה של neuromast עם ארבעה גופי תאים שיער (שחור) פנייה postsynaptic מביא נוירונים (כחול). סרטים (ירוק) תקשור שלפוחית-אתרים פעילים presynaptic בתוך כל תא. הפסגה לגוף כל תא הוא צרור של stereocilia (1 מיקרומטר) המכילים MET ערוצים. תתי שיער יש אחד kinocilium המעביר הכוח המכני של תנועה מים לבסיס של החבילה שיער. הדיאגרמה מימין מתארת באותו הדגם בתצוגה מלמעלה למטה. בתצוגה זו מלמעלה למטה, שחור משמש לציון ארבעת התאים מתואר בדיאגרמה משמאל, אפור משמשת כדי לציין neuromast בתאים אחרים. במסגרת מודל זה ונוף 2 אלה, מסומנים שלושה מטוסים חשוב: (1) טיפים של צרורות שיער (kinocilia) משמש לכמת את סדר הגודל של שיער-צרור סטיה, (2) הפסגה MET המטוס בבסיס של חבילות שיער איפה סידן חודרים לתא במהלך גירוי, (3) המטוס סינפטית בבסיס של התא שבו סידן נכנס ליד סרטי הסינפטית. (B1-B1′) DIC ו GCaMP6s תמונות מלמעלה למטה של המטרופוליטן המטוס בבסיס של חבילות שיער, איפה ניתן להקליט אותות mechanosensation תלויי סידן. (B2-B2′) DIC ו GCaMP6s תמונות מלמעלה neuromast אותו בתור B1-B1′, אבל בבסיס neuromast בתוך המטוס סינפטית, היכן שניתן לאתר אותות presynaptic סידן. (C1-C2) תמונות של neuromast לבטא GCaMP6s איפה הזחלים, מותקן כראוי. בדוגמה זו, ממוקמות בזווית שיוצרת המטוס MET הפסגה (C1) ואת המטוס סינפטית (C2) בבסיס של התא. עמדה זו אינה מאפשרת כל צרורות שיער לדימות במטוס יחיד, רבים עוד מטוסים הדמיה נדרשים כדי ללכוד את פעילות כל הסינפסות בתוך neuromast זה בהשוואה ל- B1-B2’. התמונות הן של הזחלים-5 dpf. סרגל קנה מידה בתא C2 מקביל כל התמונות בתא B1-C2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 2 : הדמיה קאמרית הרכבה דג זברה ושגרות הזרקת הלב, מחטים. (א) מוצג הוא חדר הדמיה עם זחל (שתואר על ידי מלבן מקווקו) מוצמד למרכז על גבי encapsulant סיליקון. (B1) המוצג הוא זחל dpf 5. מרותק למיטה על ידי שני פינים. סיכת ראש גדולה מונחת בניצב לגוף אחורי רק את העין. שתי עיניו הן לחלוטין נקודות המגע המוצגים כך העין התחתון מעורפל לחלוטין על-ידי העין העליון. סיכה קטנה הזנב חותך את מיתר הגב בזנב. הזחל הוא שטוח, לא מעוות. (B2) על מנת לשתק זחל, מחט ההזרקה הלב הוא בניצב אוריינטציה לגוף והביא הסמוך ללב. המחט הזרקת לב לפנות את התא פיגמנט כנגד הלב. (B2′) דיכאון של המחט לתוך העור גורמת כניסה של התא פיגמנט כנגד הלב. (ג) נידלס הסדר משמאל לימין: דוגמה של מחט ההזרקה הלב עם פתיחה של מיקרומטר כ 3; דוגמה של מחט הזרקת נוזל טוב עם פתיחה של-50 מיקרומטר; דוגמה מחט הזרקת נוזל לקוי שבור משוננים וגדולים, יהיה סביר התוצרת גירויים מופרז ובלתי לא סדיר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 3 : יישור הזרקת נוזל מיצוב, גירוי כיול. (A1) המוצג הוא זחל מונחה עם הראש שמאלה, וחדר הזנב ימינה, מחט הזרקת נוזל בכיוון מקביל לציר A-P של הגוף דג זברה. את המחט הזרקת נוזל מיושר כדי לגרות את neuromasts להגיב הקדמי (push/לחץ) וביים את ישבנה (משיכה/ואקום) זרימת נוזל. (A2) המוצג הוא של neuromast (שתואר על ידי קו מקווקו לבן) ועצות של צרורות שיער הפסגה (kinocilia) בצד שמאל הלוח המחט הזרקת נוזל בצד ימין של הפאנל. . המטוס הנוזל הוא ממוקם כ-100 מיקרומטר מקצה neuromast. (A3-A3 ‘ ‘) קצות צרורות שיער הפסגה (kinocilia) הן להסטה מרחקים שונים על ידי משתנה הזרקת נוזל גירוי לחצים. המסלול של טיפ kinocilial בודד מוצג עבור 1.5 מיקרומטר (A3 “) ו- 5 מיקרומטר (A3”) סטיה מרחקים. העיגול השחור מציין את המיקום של kinocilium. זה חשוב כי kinocilia הם לא הסיט רחוק מדי, אחרת עוצמת הגירוי לא ניתן לכמת באופן אמין ולא יכול להיות מזיק (A3 ‘ ‘). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 4 : פגשתי הפסגה ו הבזליים אותות GCaMP6s presynaptic במהלך גירוי הזרקת נוזל בתאים לרוחב קו השיער. (A1-A2 “) GCaMP6s בעוצמה משתנה במהלך גירוי הזרקת נוזל בתוך neuromast נציג. הדימויים משמאל מציגות את MET הפסגה המטוס (A1) ואת המטוס סינפטית הבזליים (A2) בתוך neuromast אותו. צבע ROIs המקודדת ב A1 ו- A2 שימשו כדי להתוות את מהלך הזמן (נ) וגרפים ΔF/F GCaMP6s עוצמת בצד ימין של כל תמונה. (B1-B1 ‘) דוגמה של רצף תמונות MET הפסגה עם עודף תנועה במהלך גירוי הזרקת נוזל. התמונה בצד השמאל (B1) מציגה את ROIs נהגו מגרש (נ) ΔF/F GCaMP6s עוצמת גרפים מימין. (C1-C1 “) דוגמה של רצף תמונות בתוך המטוס סינפטית הבזליים מראה התנועה והאיורים GCaMP6s אות שינויים שאינם אמת סידן אותות. התמונה בצד השמאל (C1) מציגה את ROIs נהגו מגרש (נ) ΔF/F GCaMP6s עוצמת גרפים מימין. תיבת אפור כל תרשים מייצג את משך הזמן של הגירוי הזרקת נוזל במהלך כל רצף תמונות. 2-s 5 הרץ הזרקת נוזל גירוי שימש הדוגמה ב A1-A2 ‘, B1-B1’. ב- C1-C1 ‘, גירוי הקדמי שלב s 2 שימש. ציר Y לתרשימים GCaMP6s (נ) מתאר יחידות שרירותי (א”א) המתקבל פיג’י התמונה בעוצמה מדידות. כל הדוגמאות הם הזחלים-dpf 4-5. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר לכל התמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת. איור 5 : ייתכן להדמיה של אותות GCaMP6s presynaptic במהלך גירוי הזרקת נוזל. השלבים כדי להמחיש את השינויים ייתכן בעוצמתם GCaMP6s בתוך neuromast במהלך הגירוי מתוארים. זמן מיוצג משמאל לימין לפי חותמת הזמן בחלק העליון של התמונות. בשורה העליונה מציגה 5 של הארגזים טמפורלית 14 של רצף תמונות GCaMP6s (נ) 70-מסגרת (שלב 13.2.1). בשורה השנייה, הבסיס (שלב 13.2) הוסר מן כל תמונה נשברתי GCaMP6s (נ) כדי ליצור תמונות ΔF (שלב 13.2.2). בשורה השלישית, הומרו ΔF תמונות של גווני אפור (שורה שנייה) כדי אדום חם LUT (שלב 13.3). Min ו- max בתמונות LUT אלו נקבעות על פי המפה חום אדום חם LUT בעוצמה היחסית ΔF (א”א) מימין (שלב 13.3.1). בשורה התחתונה, בשורה השלישית יש כבר מעולף על התמונות (נ) בשורה העליונה (שלב 13.4). הפס האפור בחלקו העליון של האיור מציין את התזמון של הגירוי הזרקת נוזל 2-s 5 הרץ. הדוגמה היא מן הזחלים dpf 5. אגדה של המפה חום אדום חם LUT בעוצמה היחסית ΔF (א”א) מוצג מימין. סרגל קנה מידה = 5 מיקרומטר לכל התמונות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Discussion
דימות in vivo בבעלי חיים שלמים הוא מטבעו מאתגר. מספר צעדים בשיטה זו הן קריטיות להשגת אמין ויוו מדידות סידן מתאי לרוחב קו השיער. לדוגמה, חשוב מאוד כי הזחל מוצמדים, משותק כראוי לפני הדמיה כדי למזער את התנועה במהלך דימות. תנועה עודפת במהלך דימות יכול להוביל שינויים בזריחה GCaMP6s כי אינם אותות אמת, שלא תואמים לשינויים ברמות הסידן (למשל, דמויות 4B1′-B1 ‘ , 4 C 1′-C1 ‘). הזנב סיכות ניתן להציב יותר anteriorly כדי לסייע במזעור התנועה, אם כי זה עלול להפוך neuromasts האחורי יותר לא נגיש. יתר על כן, לאחר ההזרקה הלב, סיכות ראש ניתן לסובב כך החלק האופקי של ה-pin שוכבת על פני החלמון. בנוסף שינוי המיקום של סיכות, זה גם ניתן להשתמש נבל פרוסות המוח במקום סיכות כדי לשתק את הזחלים34. כשהוא ממוקם על הזחלים כראוי, נבל הוא נוסף, שעשוי להיות פחות פולשני בשיטה בקיבוע הזחלים. בזמן תנועה משמעותית יכול לנבוע הצמדה לקוי, כשל לבצע כראוי את הזריקה הלב כדי לספק α-bungarotoxin, לשתק את הזחלים יכול לגרום לשיתוק לא שלם, תנועה, ותנועה בסופו של דבר חפצים. למרות הרדמה נפוץ הוכחו להשפיע על רגישות תאי שיער דג זברה, עבודה אחרונים הראו בנזוקאין הרדמה לא מפריע היבטים רבים של פעילות תאי שיער. באופן דומה, יותר נפוץ הרדמה ש-MS-222 רק מפריע היבטים מסוימים של פעילות של תאים שיער15. לכן, בשל אופיו מאתגר של α-bungarotoxin הזרקת, בנזוקאין או MS-222 יישום עשויה להיות שיטה חלופית שימושית שיתוק כדי למנוע תנועת הזחל במהלך הדמיה תפקודית סידן.
בנוסף האתגרים הטכניים שמעורבים במשימה פרוטוקול זה, אפילו מדגם נטען בצורה מושלמת היא חסרת תועלת אם זחל של תאים שיער אינם בריאים לפני כן, במהלך ניסוי הדמיה. כדי להבטיח כי הזחלים ותאים שיער בריא, חשוב כי הזחלים נשמרים במאגר E3 ללא תשלום של פסולת כגון chorions (קליפות ביצה), פסולת, מיקרואורגניזמים. למרות המיקום שטחית של תאים שיער קו הצד היא יתרון עבור הדמיה, מיקום זה הופך אותם לפגיעים יותר נזק תאי כאשר המאגר E3 היא עבירה. סביבה נקייה, מימית חשוב במיוחד עבור הזחלים הצעירים (2-4 dpf) או מוטציות. זה לא יכול לשמור על שחייה זקוף מקם ולשקר בעיקר בתחתית הפטרי. במצבים אלה, לרוחב קו השיער והתאים את cupula מגן סביב השיער חבילות יכול בקלות להיות בסכנה. גם כאשר החל הזחלים בריא תאים שיער, לאורך כל הניסוי, חיוני כדי להבטיח כי הזחל כולל פעימות, זרימת דם מהירה. אם זרימת הדם מאט או מפסיקה, הבריאות של תאי השיער יכול להיות בסכנה. פרוץ ההכנות לערב הזחלים לא בריא או אובדן של זרימת הדם, למות תאים שיער ניתן לזהות מספר דרכים: הראשונה, המראה של karyopyknosis או גרעיני התעבות, הבאה לידי ביטוי כמו בועה בתוך התא תחת DIC אופטיקה; שנית, על ידי תא הצטמקות ואת נוכחותם של נעה במהירות חלקיקים בתוך הציטופלסמה; והשלישי, כאשר kinocilia טיפים לפעור כיוונים שונים35. כאשר הם צרורות שיער, להזיז kinocilia splayed לא cohesively יחד במהלך גירוי.
ההכנה הזאת יש מספר מגבלות קלות, אחד להיות ההכנה רק נותרת איתנה במשך 1-3 שעות לאחר שהיא מתקבלת. שינויים כגון שימוש סיכות קטנות יותר או פרוסות המוח של נבל לשתק את הזחלים, הוספת מערכת זלוף רשאי להאריך את אורך החיים של הכנת ויוו . מגבלה נוספת היא photobleaching הזה, phototoxicity עלולה להתרחש לאחר חזר הדמיה ניסויים. דרך מרגשת אחת כדי להתגבר על האתגר הזה נועד להתאים פרוטוקול זה עבור מיקרוסקופ אור גיליונות. מיקרוסקופ אור גיליונות היא דרך רבת עוצמה כדי להפחית מאור המוקד, שמוביל פחות photobleaching ו- phototoxicity36. יחד, קיבעון עדינה וחשיפה פחות צילום-עשוי לסייע להאריך כל מושב הדמיה. הפעלות עוד הדמיה ניתן לבחון המשך מלא של שינויים פונקציונליים ליווי ופיתוח התהליכים שבבסיס סיווג תאים שיער והתחדשות לאחר פציעה. חשוב לציין כי בנוסף מיקרוסקופ אור גיליונות, פרוטוקול זה ניתן להתאים מערכות קונאפוקלית אחרות סוגים (לסריקת נקודה 2-פוטון, המסתובבים דיסק) כמו גם widefield פשוט יחסית מערכות28,34 . בסך הכל, צדדיות שלה עושה את זה פרוטוקול כלי חשוב כי ניתן הותאם בשימוש עם מספר מערכות הדמיה.
בעוד פרוטוקול זה יכול להיות הותאם בשימוש עם מערכות הדמיה רבים, חלקים של פרוטוקול זה יכול גם להיות מותאם ומשמשת (1) עם סממנים אחרים חוץ GCaMP6s, (2) כדי התמונה פעילות תאי חישה אחרים של נוירונים בתוך דג זברה זחל. לדוגמה, במחקר הקודם, השתמשנו פרוטוקול זה לפעילות התמונה באמצעות מחווני מקודדים גנטית מרובות בתוך תאים שיער קו הצד כדי לזהות סידן cytosolic (RGECO1), שלפוחית פיוז’ן (syphy ב), מתח הממברנה (Bongwoori), קרום סידן (jRCaMP1a-caax ו- GCaMP6s-caax), ובתוך קו הצד תהליכים מביא לגילוי ממברנה סידן (GCaMP6s-caax)5. על סמך הניסיון שלנו שימוש במחוונים אלה, הקו הטרנסגניים ש-tg(myo6b:gcamp6s-caax) המתוארות פרוטוקול זה מציע התחלה מצויינת הדמיה פעילות קו הצד neuromasts. של כל האינדיקטורים המפורטים לעיל, מצאנו כי GCaMP6s הוא רגיש ביותר, photostable. בנוסף לתכונות אלו, אנחנו להדגיש קו הטרנסגניים Tg(myo6b:GCaMP6s-caax) כי זה יכול לשמש כדי להפוך שתי מדידות שונות: שיער-תא mechanosensation וסידן presynaptic בתוך הטרנסגניים שורה אחת.
הטכניקה שתואר במאמר זה מדגים איך סידן הדמיה בשורה לרוחב דג זברה יכולה להיות שיטה חזקה כדי ללמוד כיצד תאים שיער לתפקד בסביבה הטבעית שלהם. גישה זו היא משלימה מחקרים של יונקים בתא שבו השיער פונקציה היא כיום נחקר ב explants vivo לשעבר . בנוסף, המודל דג זברה תוכל להמשיך לשמש כפלטפורמה כדי לבדוק את היעילות של אינדיקטורים מקודדים גנטית שניתן להחיל ואז לבחון פעילות בתרבית של תאי שיער.
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי NIH/NIDCD מחקר מגזר קרנות 1ZIADC000085-01 (K.S.K.). ברצוננו להודות וונג ממתקים על הסיוע בכתיבת המאקרו פיג’י. כן נרצה להודות דוריס Wu ווונג ממתקים על ההערות המועילות שלהם עם הפרוטוקול.
Materials
| Section 1 | |||
| α-Bungarotoxin | R&D Systems | 2133 | For paralyzing larvae prior to imaging |
| Phenol red Solution 0.5% | Sigma-Aldrich | P0290 | For visualization of α-bungarotoxin solution during heart injection |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate (MESAB, MS-222, tricaine) | Sigma-Aldrich | A5040 | For anesthetizing larvae |
| Section 2 | |||
| Imaging chamber | Siskiyou | PC-R | Platform to mount larvae for imaging |
| No. 1.5 Coverslips square, 22*22 mm | VWR | 48366-227 | To seal imaging chamber |
| High vacuum silicone grease | Fischer Scientific | 14-635-5D | For affixing of coverslip to imaging chamber |
| Silicone encapsulant clear 0.5 g kit | Ellsworth Adhesives | Dow Corning Sylgard, 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | To fill imaging chamber to create a surface to pin fish |
| Oven | Techne | HB-1D | For drying silicone encapsulant |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating wire, forceps and scissors to make pins |
| Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For making pins |
| Fine scissors | Cole-Palmer | 5.5", EW-10818-00 | For cutting tunsgten wire to make pins |
| Tungsten wire, 0.035 mm | Goodfellow | W005131 | For head pins to immobilize larvae |
| Tungsten wire, 0.025 mm | ThermoFischer Scientific | AA10405-H4 | For tail pins to immobilize larvae |
| Section 3 | |||
| Micropipette guller | Sutter Instrument Company | P-97 | For pulling capillary glass for fluid-jet and heart injection needles |
| Borosilicate glass capillaries w/ filament | Sutter Instrument Company | BF 150-86-10 | Glass to be pulled into α-bungarotoxin injection needles for heart injection |
| Borosilicate glass capillaries w/o filament | Sutter Instrument Company | B 150-86-10 | Glass to be pulled into fluid-jet needles to stimulate hair cells |
| Pipette polisher | Narishige | MF-830 microforge | To polish fluid-jet pipette tips to smooth jagged breaks |
| Ceramic tile | Sutter Instrument Company | NC9569052 | For scoring and evening breaking fluid-jet needles |
| Sections 4 & 5 | |||
| Fine forceps | Fine Science Tools | Dumont #5 (0.05 x 0.02 mm) Item No. 11295-10 | For pinning larvae |
| Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling heart injection needles |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss Microscopy | Stemi 2000 with transmitted light illumination | For illuminating larvae during pinning and heart injection |
| Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
| Manual micromanipulator | Narishige | M-152 | For holding and positioning of needle holder to inject α-bungarotoxin |
| Magnetic stand | Narishige | GJ-1 | For holding manual micromanipulator for α-bungarotoxin injection |
| Pressure injector | Eppendorf | Femtojet 4x | To deliver α-bungarotoxin |
| Sections 6, 7 & 8 | |||
| Confocal microscope | Bruker | Swept field/Opterra confocal microscope | Fixed, upright microscope with DIC optics and 488nm laser with appropriate filters |
| Microscope software | Bruker | Prairieview 5.3 | To coordinate and control the microscope, lasers, stage, piezo-z, cameras and fluid jet |
| 10X air objective | Nikon | MRH00101 | Low magnification for positioning of larvae and fluid jet |
| 60X water objective | Nikon | MRF07620 | Water immerison objective with high NA (1.0) and adequate working distance (2.0 mm) |
| Piezo-Z objective scanner with controller/driver | Physik Intruments instruments/Bruker | 01144210/UM-Z-PZ | High-speed z-stack acquisition with 0.025um accuracy |
| EMCCD camera | QImaging | Rolera EM-C2 EMCCD camera | Camera with small pixel size that can acquire up to 100 frames per s |
| Circular chamber adapter | Siskiyou | PC-A | For holding and rotating imaging chamber on microscope stage |
| Motorized Z-deck stage | Prior Scientific | ZDN12MP | Microscope stage that can hold and move sample and micromanipulator with fluid-jet needle together |
| Z-deck stage insert adaptor | NIH Machine shop | custom | To fit the circular chamber adaptor onto the z-deck stage |
| Fluid-jet apparatus | ALA scientific instruments | HSPC-1 High-speed pressure Clamp with PV-PUMP | For controlling and delivering the fluid-jet stimulus |
| Masterflex Peroxide-cured silicone tubing (1 ft) | Cole-Palmer | Masterflex L/S 13, 96400-13 | For connecting the fluid-jet needle holder to pressure pump |
| Motorized micromanipulator | Sutter Instrument Company | MP-225 | For holding and positioning of needle holder for fluid jet |
| Micromanipulator controller | Sutter Instrument Company | MPC-200 | For controlling fluid-jet needle manipulator |
| Gel loading tips | Eppendorf | 5242956003 | For backfilling fluid-jet needles |
| Glass capillary/needle holder | WPI | MPH315 | To hold fluid-jet needles |
| PSI manometer | Sper Scientific | 840081 | For measuring pressure clamp output |
| Section 9 | |||
| BAPTA, Tetrapotassium Salt, cell impermeant | ThermoFischer Scientific | B1204 | To cleave tips links, uncouple MET channels and block all evoked GCaMP6s signals |
| Isradipine | Sigma-Aldrich | I6658 | To block signals dependent on the L-type calcium channels (CaV1.3) at the presynapse |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Solvent for pharmacological compounds |
| Section 10 | |||
| Prism7 | Graphpad | Prism7 | Software to plot GCaMP6 intensity changes |
| FIJI | Schindelin, et., al.34 | https://fiji.sc/ | Software to process images and create spatio-temporal signal maps |
| Turboreg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
| StackReg Plugin | Thévenaz et., al.29 | http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/ | Plugin to register GCaMP6 image sequences in FIJI |
| Times Series Analyzer V3 Plugin | Balaji J 2007, Dept. of Neurobiology, UCLA | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/time-series.html | Plugin to create multiple ROIs to measure GCaMP6 intensity changes |
参考文献
- Russell, J. T. Imaging calcium signals in vivo: a powerful tool in physiology and pharmacology. British Journal of Pharmacology. 163 (8), 1605-1625 (2011).
- Pérez Koldenkova, V., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: Properties and evaluation. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) – Molecular Cell Research. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Lin, M. Z., Schnitzer, M. J. Genetically encoded indicators of neuronal activity. Nature Neuroscience. 19 (9), 1142-1153 (2016).
- Tian, L., Hires, S. A., Looger, L. L. Imaging Neuronal Activity with Genetically Encoded Calcium Indicators. Cold Spring Harbor Protocols. 2012 (6), (2012).
- Zhang, Q., et al. Synaptically silent sensory hair cells in zebrafish are recruited after damage. Nature Communications. 9 (1), 1388 (2018).
- Harris, G. G., Frishkopf, L. S., Flock, A. Receptor potentials from hair cells of the lateral line. Science. 167 (3914), 76-79 (1970).
- Eatock, R. A. Vertebrate Hair Cells: Modern and Historic Perspectives. Vertebrate Hair Cells. , 1-19 (2006).
- Tang, L. S., Montemayor, C., Pereira, F. A. Sensorineural hearing loss: potential therapies and gene targets for drug development. IUBMB Life. 58 (9), 525-530 (2006).
- Assad, J. A., Shepherd, G. M. G., Corey, D. P. Tip-link integrity and mechanical transduction in vertebrate hair cells. Neuron. 7 (6), 985-994 (1991).
- Lumpkin, E. A., Hudspeth, A. J. Detection of Ca2+ entry through mechanosensitive channels localizes the site of mechanoelectrical transduction in hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (22), 10297-10301 (1995).
- Ricci, A. J., Wu, Y. -. C., Fettiplace, R. The Endogenous Calcium Buffer and the Time Course of Transducer Adaptation in Auditory Hair Cells. Journal of Neuroscience. 18 (20), 8261-8277 (1998).
- Moser, T., Beutner, D. Kinetics of exocytosis and endocytosis at the cochlear inner hair cell afferent synapse of the mouse. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (2), 883-888 (2000).
- Brandt, A., Khimich, D., Moser, T. Few CaV1.3 channels regulate the exocytosis of a synaptic vesicle at the hair cell ribbon synapse. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 25 (50), 11577-11585 (2005).
- Olt, J., Allen, C. E., Marcotti, W. In vivo physiological recording from the lateral line of juvenile zebrafish. The Journal of Physiology. 594 (19), 5427-5438 (2016).
- Olt, J., Johnson, S. L., Marcotti, W. In vivo and in vitro biophysical properties of hair cells from the lateral line and inner ear of developing and adult zebrafish. The Journal of Physiology. 592 (10), 2041-2058 (2014).
- Griguer, C., Fuchs, P. A. Voltage-dependent potassium currents in cochlear hair cells of the embryonic chick. Journal of Neurophysiology. 75 (1), 508-513 (1996).
- Art, J. J., Fettiplace, R. Variation of membrane properties in hair cells isolated from the turtle cochlea. The Journal of Physiology. 385, 207-242 (1987).
- Goutman, J. D., Pyott, S. J. Whole-Cell Patch-Clamp Recording of Mouse and Rat Inner Hair Cells in the Intact Organ of Corti. Methods in Molecular Biology. 1427, 471-485 (2016).
- Einarsson, R., et al. Patch Clamp Recordings in Inner Ear Hair Cells Isolated from Zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (68), (2012).
- Fuchs, P. A. Time and intensity coding at the hair cell’s ribbon synapse. The Journal of Physiology. 566, 7-12 (2005).
- Moser, T., Brandt, A., Lysakowski, A. Hair cell ribbon synapses. Cell and Tissue Research. 326 (2), 347-359 (2006).
- Trapani, J. G., Nicolson, T. Chapter 8 – Physiological Recordings from Zebrafish Lateral-Line Hair Cells and Afferent Neurons. Methods in Cell Biology. 100, 219-231 (2010).
- Olt, J., Ordoobadi, A. J., Marcotti, W., Trapani, J. G. Physiological recordings from the zebrafish lateral line. Methods in Cell Biology. 133, 253-279 (2016).
- Stawicki, T. M., Esterberg, R., Hailey, D. W., Raible, D. W., Rubel, E. W. Using the zebrafish lateral line to uncover novel mechanisms of action and prevention in drug-induced hair cell death. Frontiers in Cellular Neuroscience. 9, (2015).
- Spinelli, K. J., Gillespie, P. G. Monitoring Intracellular Calcium Ion Dynamics in Hair Cell Populations with Fluo-4 AM. PLOS ONE. 7 (12), 51874 (2012).
- Kwan, K. M., et al. The Tol2kit: a multisite gateway-based construction kit for Tol2 transposon transgenesis constructs. Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 236 (11), 3088-3099 (2007).
- Zhang, Q. X., He, X. J., Wong, H. C., Kindt, K. S. Chapter 10 – Functional calcium imaging in zebrafish lateral-line hair cells. Methods in Cell Biology. 133, 229-252 (2016).
- Sheets, L., et al. Enlargement of Ribbons in Zebrafish Hair Cells Increases Calcium Currents But Disrupts Afferent Spontaneous Activity and Timing of Stimulus Onset. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 37 (26), 6299-6313 (2017).
- Chou, S. -. W., et al. A molecular basis for water motion detection by the mechanosensory lateral line of zebrafish. Nature Communications. 8 (1), 2234 (2017).
- Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Transactions on Image Processing. 7 (1), 27-41 (1998).
- . Fiji is just ImageJ Available from: https://fiji.sc/ (2018)
- Esterberg, R., Hailey, D. W., Coffin, A. B., Raible, D. W., Rubel, E. W. Disruption of intracellular calcium regulation is integral to aminoglycoside-induced hair cell death. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (17), 7513-7525 (2013).
- Stengel, D., Zindler, F., Braunbeck, T. An optimized method to assess ototoxic effects in the lateral line of zebrafish (Danio rerio) embryos. Comparative Biochemistry and Physiology Part C: Toxicology & Pharmacology. 193, 18-29 (2017).
- Fadero, T. C., et al. LITE microscopy: Tilted light-sheet excitation of model organisms offers high resolution and low photobleaching. Journal of Cell Biology. , (2018).
