プローブに細菌の病原体を用いた細胞・生体レベルのホスト応答
概要
ホスト エンコード要因の活動を分析する使用ことができます両方生体外でそして生体内で感染の試金を記述します。
Abstract
細菌性病原体が存続し、かつて真核生物の細胞内増殖を採用戦略のさまざまながあります。いわゆる ‘細胞’ 病原体 (リステリア菌赤痢菌、細菌病菌 pseudomallei、野兎病菌、リケッチア属) による感染細胞の細胞質へのアクセスします。物理的に、酵素によってプライマリの液胞膜を分解します。一度、細胞質でこれらの病原体増殖し同様両方新しい細胞を感染させるために宿主細胞の細胞膜を貫通する十分な機械的な力を生成します。ここで、菌、リステリア菌(Lm) の細胞感染サイクルのこの最終段階のコロニー形成単位アッセイとフローサイトメトリーにより定量化することができ、これ両方の病原体およびホストでエンコードされた要因の影響の例を与える方法を紹介します。プロセス。また, Lm感染培養細胞動態の近い対応が生体外で感染しているし、感染肝細胞に由来するマウスの体内.これらの関数に基づく試金は比較的単純であり、真核生物細胞の機能の変調器のための高スループット画面の検出ベース容易に拡張できます。
Introduction
感染症に基づく実験的モデル、ホスト、そして病原体、様々 な病原体の感染戦略と病原体がホスト主導するプロセスに結び付ける難易度の開始状態への依存のために本質的に挑戦結果に基づきます。菌リステリア菌(Lm) の遺伝学的および微生物学的少ない、その迅速かつプロセッシブ細胞感染戦略と比較的明確なのためのに対する宿主の防御をプローブする理想的な病原体となっています。その携帯と生体レベルの感染症の表現型間の関係。Lmの細胞感染を通過 4 段階1: (i) Lm ; 液胞で囲まれた中で結んで細胞浸潤(ii) Lm-液胞膜の溶解と細胞質; にLmの放出を指示(iii) intracytosolic レプリケーションそして (iv) 膜結果直接隣接する細胞 (上皮シートなど) のどちらかの感染または孤独な細胞は細胞外の環境にLmのリリースの物理的な侵入。特定Lmによって促進される、これらの各フェーズ-要因 (‘病原因子」と呼ばれる) をエンコードされたが、削除されると、原因の感染欠陥細胞と動物のモデル。この一般的な感染戦略されて独立して進化しているいわゆる ‘細胞’ 病原体2の数によって。
コロニー形成単位 (CFU) 試金は体外の両方を評価するため利用されています (すなわち、細胞) 同様の in vivo (すなわち、,) 感染症の結果。生体内での感染症のために特に感度が高くに加えて CFU の試金は病原体の侵入と細胞の生存/増殖のため明確な読み出しを提供します。CFU アッセイは、感染に影響を与えるLmとホストの両方の細胞の要因を分析するため広く使用されています。これらの先行研究は細胞浸潤と intracytosolic レプリケーションを分析されている有益 CFU の試金、我々 の知識を最大限に使用されていないLm感染プロセスの第 4 段階を追跡する: 細胞エスケープ。ここでは、比較的単純な CFU の試金 (およびフローサイトメトリーによって) (以下、出現’) 携帯の脱出の手段を監視ことができ、どのように両方の病原体およびホストでエンコードされた要因の例を示す規制Lm のこの段階について述べる感染サイクル。携帯電話のLm感染サイクル ターミナル相の解析追加病原体および宿主細胞感染特異的因子と活動を識別することが可能になります。
Protocol
Representative Results
Discussion
その迅速かつプロセッシブ細胞感染プログラムLm感染に影響を与える細胞の活動を調査する理想的な病原体です。ホストの要因の数が肯定的または否定的に影響を与えるLm細胞感染11,12,13,14に同定されています。2 つのような宿主因子研究室、パーフォリン 2 とヘム調節剤の特徴 (P2、?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Materials
| ACK Lysing Buffer | Gibco | A1049201 | |
| ArC Amine Reactive Compensation Beads | Life Technologies | A10346 | |
| BHI (Brain Heart Infusion) broth | EMD Milipore | 110493 | |
| Cell Strainer, 70 µm | VWR | 10199-656 | |
| Collagenase D | Roche | 11088858001 | |
| DMEM media | Gibco | 11965-092 | |
| FACS tubes | BD Falcon | 352054 | |
| FBS – Heat Inactivated | Sigma-Aldrich | F4135-500ML | |
| Hanks’ Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H6648-6X500ML | |
| LB agar | Grow Cells MS | MBPE-4040 | |
| LIVE/DEAD Fixable Yellow Dead Cell Stain kit | Life Technologies | L349S9 | |
| Rhodamine Phalloidin | Thermo Fischer | R415 | |
| SP6800 Spectral Analyzer | Sony | ||
| Syringe 28G 1/2" 1cc | BD | 329461 | |
| TPP Tissue Culture 48 Well Plates | MIDSCI | TP92048 | |
| TPP Tissue Culture 6 Well Plates | MIDSCI | TP92406 | |
| UltraComp eBeads | eBioscience | 01-2222-42 | |
| Antigen | |||
| CD11b | Biolegend | Flurochrome = PE Cy5, Dilution = 1/100, Clone = M1/70 | |
| CD11c | Biolegend | Flurochrome = AF 647, Dilution = 1/100, Clone = N418 | |
| CD45 | Biolegend | Flurochrome = APC Cy7, Dilution = 1/100, Clone = 30-F11 | |
| F4/80 | Biolegend | Flurochrome = PE, Dilution = 1/100, Clone = BM8 | |
| Live/Dead | Invitrogen | Flurochrome = AmCyN, Dilution = 1/100 | |
| Ly6C | Biolegend | Flurochrome = PacBlue, Dilution = 1/200, Clone = HK1.4 | |
| MHC II | Biolegend | Flurochrome = AF 700, Dilution = 1/200, Clone = M5/114.15.2 | |
| NK 1.1 | Biolegend | Flurochrome = BV 605, Dilution = 1/100, Clone = PK136 |
参考文献
- Freitag, N. E., Port, G. C., Miner, M. D. Listeria monocytogenes – from saprophyte to intracellular pathogen. Nature Review Microbiology. 7 (9), 623-628 (2009).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nature Review Microbiology. 7 (5), 333-340 (2009).
- Miner, M. D., Port, G. C., Freitag, N. E. Functional impact of mutational activation on the Listeria monocytogenes central virulence regulator PrfA. 微生物学. 154, 3579-3589 (2008).
- McCormack, R., et al. Perforin-2 Protects Host Cells and Mice by Restricting the Vacuole to Cytosol Transitioning of a Bacterial Pathogen. Infection and Immunity. 84, 1083-1091 (2016).
- Gregory, S. H., et al. Complementary adhesion molecules promote neutrophil-Kupffer cell interaction and the elimination of bacteria taken up by the liver. Journal of Immunology. 168, 308-315 (2002).
- Shi, C., et al. Monocyte trafficking to hepatic sites of bacterial infection is chemokine independent and directed by focal intercellular adhesion molecule-1 expression. Journal of Immunology. 184, 6266-6274 (2010).
- Pitts, M. G., Combs, T. A., D’Orazio, S. E. F. Neutrophils from Both Susceptible and Resistant Mice Efficiently Kill Opsonized Listeria monocytogenes. Infection and Immunity. 86, 00085 (2018).
- Carr, K. D., et al. Specific depletion reveals a novel role for neutrophil-mediated protection in the liver during Listeria monocytogenes infection. European Journal of Immunology. 41 (9), 2666-2676 (2011).
- Blériot, C., et al. Liver-resident macrophage necroptosis orchestrates type 1 microbicidal inflammation and type-2-mediated tissue repair during bacterial infection. Immunity. 42 (1), 145-158 (2015).
- Jones, G. S., D’Orazio, S. E. F. Monocytes are the predominant cell type associated with Listeria monocytogenes in the gut, but they do not serve as an intracellular growth niche. Journal of Immunology. 198, 2796-2804 (2017).
- Agaisse, H., et al. Genome-wide RNAi screen for host factors required for intracellular bacterial infection. Science. 309, 1248-1251 (2005).
- Cheng, L. W., et al. Use of RNA interference in Drosophila S2 cells to identify host pathways controlling compartmentalization of an intracellular pathogen. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 102, 13646-13651 (2005).
- Singh, R., Jamieson, A., Cresswell, P. GILT is a critical host factor for Listeria monocytogenes infection. Nature. 455, 1244-1247 (2008).
- Burrack, L. S., Harper, J. W., Higgins, D. E. Perturbation of vacuolar maturation promotes listeriolysin O-independent vacuolar escape during Listeria monocytogenes infection of human cells. Cellular Microbiology. 11, 1382-1398 (2009).
- Shrestha, N., et al. The host-encoded Heme Regulated Inhibitor (HRI) facilitates virulence-associated activities of bacterial pathogens. PLoS One. 8, 68754 (2013).
- Bahnan, W. The eIF2α Kinase Heme-Regulated Inhibitor Protects the Host from Infection by Regulating Intracellular Pathogen Trafficking. Infection and Immunity. 20, 00707 (2018).
- Kortebi, M., et al. Listeria monocytogenes switches from dissemination to persistence by adopting a vacuolar lifestyle in epithelial cells. PLoS Pathogen. 13, 1006734 (2017).
- VanCleave, T. T., Pulsifer, A. R., Connor, M. G., Warawa, J. M., Lawrenz, M. B. Impact of Gentamicin Concentration and Exposure Time on Intracellular Yersinia pestis. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 7, 505 (2017).
