Burada büyük ölçüde yüksek hassasiyet ile bağlama benzeşim denge ve çözüm belirlemek için yeni bir yöntem mevcut. Bu transkripsiyon faktörü-DNA bağlayıcı kantitatif analiz artırır. Yönteminin otomatik floresans anizotropi ölçümlerde kontrollü bir iletim sistemi temel alır.
Transkripsiyon faktörü (TF) doğru miktar-DNA etkileşimleri Gen ifadesinin düzenlenmesinde anlamak için gerekli. Varolan yaklaşımları önemli kısıtlamalar acı beri TF-DNA bağlayıcı benzeşim büyük ölçüde yüksek hassasiyetle belirlemek için yeni bir yöntem geliştirdik. Tahlil kurulan floresans anizotropi (FA) ilkesine dayanır ama önemli teknik geliştirmeler içerir. İlk olarak, TF ve fluorescently etiketli başvurusu DNA gözenekli özel jel Matristeki dahil ederek tek iyi bir tam SK rekabetçi titrasyon eğrisi ölçüyoruz. Etiketlenmemiş DNA oligomer üstünde belgili tanımlık tepe rakip olarak yüklenir ve difüzyon spatio-zamansal bir degrade oluşturur. Elde edilen SK geçişin ardından özelleştirilmiş epifluorescence mikroskop kurulumu kullanarak okunur. Bu gelişmiş kurulum büyük FA sinyal algılama, güvenilir, hatta benzer moleküler ağırlık moleküller için sayısal güçlü ve zayıf bağlamaya izin vererek hassasiyeti artırır. Bu şekilde çok iyi bir tabak kuyu başına bir titrasyon eğrisi ölçebilir ve uygun yordam, biz mutlak ayrışma sabiti (KD) ve aktif protein konsantrasyonu ayıklayabilirsiniz. Tüm tek nokta mutasyon değişik sıralı bağlama belirli bir fikir birliği test ederek, genellikle tek bir plaka üzerinde bir TF tüm bağlamayı özgüllük manzara anket. Elde edilen pozisyon ağırlık matrisleri (PWMs) bu vivo içinde TF doluluk öngörmede diğer yöntemleri elde daha iyi performans. Burada, geleneksel otomatik floresan mikroskop ve veri analiz boru hattı üzerinde HiP-FA uygulamak için ayrıntılı bir rehber mevcut.
Transkripsiyon faktörleri (TFs) merkezi rol bağlama tercihlerini nicel bir şekilde büyük önem olduğunu belirleme gen Yönetmelikte verilen. Öyle ki RNA polimeraz organizatörü için işe aşağı akım olaylar tarafından denetlenir kendi bağlama iyi termodinamik denge tarafından açıklanan seminal çalışmaları von Hippel tarafından yasal TFs hızla DNA, tanımak kavramı tanıttı daha yavaş kinetik1. Vivo bağlama çalışmalar büyük olasılıkla daha karmaşık2,3, bu tablo öneririz; Bununla birlikte, bu genel varsayımlar iyi yaklaşımları hizmet ve CIS düzenleyici elemanlarının bulmak ve dizileri4,5,6ifade tahmin etmek için birçok hesaplama yaklaşımlar destekledim. Denge bağlama böylece başarıyla bir kavram olarak istihdam edilmiştir, TF-DNA etkileşimleri belirlemek için geçerli yöntemleri özgüllük bağlama odaklanmak ve genellikle doğrudan ölçü birimi bağlama benzeşim, denge yok. TF-DNA bağlayıcı sistematik ölçümü önemli bir teknik sorun temsil eder ve varolan yöntemleri birkaç farklı kısıtlamalar bulunmaktadır.
(ChIP-seq)7, en yaygın vivo içinde tekniği, sıralama derin tarafından takip kromatin immunoprecipitation bağlama benzeşim ölçümü veya siteler genomik parçaları içinde bağlama hassas yerelleştirme izin vermez. DNaz footprinting8, elektroforetik hareketlilik ÜSTKRKT (Emsan)9, yüzey plasmon rezonans (SPR)10ve microscale thermophoresis11 de dahil olmak üzere birkaç vitro yöntem bağlama benzeşim ölçmek mümkün, Ama onlar nispeten düşük işlem hacmi. Bunun tersi olarak, protein bağlayıcı microarrays12, HT-SELEX13,14ve bakteriyel bir hibrid (B1H)15 de dahil olmak üzere yüksek işlem hacmi teknikleri bağlama benzeşim ölçmek ve genellikle aşırı verim mümkün değildir özel sıraları, esas olarak sıkı seçim nedeniyle bağlama veya adımları gerekli yıkama. Daha yeni gelişmeler derin sıralama dayalı sayısı-FLIP16, SELEX seq17ve havacilik-esaslı MITOMI18 veya gülümseme-Seq19, mutlak bağlayıcı benzeşim çıkarılması için izin içerir; Ancak, onlar floresans yoğunluklarda etiketli TF ve DNA ölçme üzerinde güveniyor. Düşük protein konsantrasyonları ve düşük KD değerleri belirlemede sınırlama olmak floresan sinyallerini, bu nedenle, (< ~ 10 nM). Ayrıca, bu yöntemler TF-DNA bağlamasında belirsiz bağlama ve/veya doğru bir şekilde zayıf bağlama ölçmek zordur otomatik floresans arka plan ile sorunları yükselterek, ince yüzeyler üzerinde yer almaktadır.
Bu sınırlamaları gidermek için TF-DNA benzeşme manzara denge ve yüksek performanslı floresans anizotropi (HiP-FA)20aradık çözüm belirlemek için yeni bir yöntem geliştirdi. Teknik üzerinde kurulan floresans anizotropi (FA) tahlil21 temel ancak bağlama sabitler ile yüksek hassasiyet ve büyük ölçekli bir özelleştirilmiş otomatik mikroskop ve analiz kurulumunu kullanarak ölçmek için değiştirilmiş.
SK tahlil (gibi bir DNA oligomer) fluorescently etiketli türler arasındaki etkileşimin bir TF, bu durumda bir bağlama ortağına etiketli molekülünün moleküler döndürme ölçerek izler. TF için bağlama üzerine daha yüksek hidrodinamik RADIUS ve artan SK sonuç ilişkili karmaşık molekül ağırlığı nedeniyle onun dönüş hızı azalır. Çok güçlü bağlama doğru ölçüm (KD < ~ 1 nM) etiketli, referans DNA düşük konsantrasyonlarda kullanımını gerektirir (c < ~ 1 nM). Bu standart Mikroplaka okuyucusu gibi ticari bir araç elde etmek zordur. Buna ek olarak, bir büyük boy farkı (10-100 kat) ilişkili ve ilişkisiz kompleksleri genellikle gerekli ölçüm TF bağlayıcı etki alanları ve olan genellikle aşağı yukarı benzer moleküler ağırlıkları kısa DNA reaksiyonlar arasında bir köprü işlevi yasaklayan . Son olarak, bir tam titrasyon eğrisi normalde hazırlık ve ölçüm titrating türler için konsantrasyon içeren birden çok Wells gerektirir.
Bu sorunlara yönelik olarak yüksek algılama hassasiyet elde etmek ve SK ölçüleri farklı z-konumlarda bir tek şey izin vermek için değiştirilmiş bir widefield mikroskobu kurulum kullanın. Bu tür benzer molekül ağırlığı ve yüksek benzeşim ile arasındaki bağlama etkileşimleri izlemek sağlar. Yüksek işlem hacmi çok iyi plaka biçimleri ve tüm titrasyon dizisi de bir kontrollü teslimat sistemi (Şekil 1bir) kullanarak tek bir yerine getiren SK ölçerek elde edilir. Ayrıca, bir rekabetçi bağlama tahlil istihdam ederek, biz sadece da aktif protein konsantrasyonu bağlama sabitler ayıklayın. Yalnızca bir bölümünü ifade TF molekülleri protein misfolding veya bozulması nedeniyle etkin olduğundan bu testin, önemli bir özelliktir. Deneysel Kur XY ve Z piezo aşamaları ile donatılmış bir ticari epifluorescence mikroskop temel alır. Biz dış lazer uyarma sistemiyle yükseltilmiş sonra iki ışık algılama (Şekil 1b ve 1 c) için yüksek kuantum verimliliği ile doğrusal polarizasyon bileşenleri bir EM-CCD kamera yonga üzerinde yayılan algılandı. Sistem bir ultra-hassas sensör birleştiğinde bir yüksek sayısal diyafram (NA) hedefi kullanır ve böylece son derece hassas SK ölçümleri affords. Floresans z-yığınlar kaydederek, etkileşimleri bağlama optik z ekseni heterojen bir matris için Reaktanları kullanırken ölçülebilir. Tüm bu değişiklikler varolan bir sistemde kolayca uygulanabilir ve maliyet-etkin.
Biz hangi bir referans olarak hizmet vermektedir fluorescently etiketli DNA ile karşılaştırıldığında etiketlenmemiş bir DNA oligomer bağlama benzeşme ölçülür bir rekabetçi bağlama tahlil istihdam. TF ve başvuru DNA bağlama için bir sigara etkileşim ortamı oluşturan bir gözenekli özel jel matris (gözenek boyutu ~ 1 µm) sabit konsantrasyonlarda dahil edilmiştir. Referans DNA Cy5 ile etiketlenir. Bu boya nispeten uzun floresan ömrü nedeniyle SK ölçümler için uygun kanıtladı (~ 1ns) ve floresan emisyon far-red içinde görünür spektrumun (düşük auto-floresan arka plan). Tüm başvuru DNA protein bağlı garanti Cy5-başvuru DNA üzerinde molar fazla TF bölgedir. Etiketlenmemiş rakip DNA çözüm sonra jel yüzeyinde yatırılır ve üzerinde zdeğiştirir bir konsantrasyon gradyanı c (z, t) kurulması gözenekli matris içinde dağılır-odak düzlemi ve zaman t (Şekil konumunu 1a, Şekil 2-2 c). Cy5-başvuru DNA bağlı TF böylece yerel olarak rakip bağlama için yarışan DNA Cy5-başvuru DNA SKREF(z, t) dinamik olarak değişen bir FA için önde gelen farklı konsantrasyonlarda maruz kalmaktadır (Şekil 2b ve 2 c).
Rakip konsantrasyon c(z,t) belirlemek için biz ayrı wells (kalibrasyon wells) dinamik olarak değişen SK sinyal Nil Blue (NB) SKNB(z, t) ölçü (Şekil 2bir ve 3). Bu boya DNA intercalates ve böylece rakip DNA için DNA sensör davranır. Bu kontrollü iletim sistemi ile bir çok iyi plaka (96 – veya 384-da plaka biçimi) içinde onlarca yüzlerce farklı DNA-protein bağlayıcı benzeşim ölçülebilir. Ölçüm sonra TF etiketli başvurusundan DNA tam yerinden kadar sırayla gerçekleştirilir. Biz belirli bir faktör için bağlama özgüllük benzeşim, uzunluk Nfikir birliği dizi tüm 3 N tek-base mutasyonların ölçerek belirledi. HiP-FA protein düşük miktarda gerektirir (~ pmols titrasyon eğrisi başına) ve gösterir düşük değişkenlik ölçüleri nispeten büyük ölçüde izin verirken KDs [değişim (CV) < %20 katsayısı], belirlenmesi. Yöntem daha düşük CVs (Şekil 4, üst paneli) kaynaklanan bir robotik sistem kullanarak el ile veya tam otomatik yapılabilir. Ayrılma sabitler 0,5 aşağı yüksek doğruluk ile ölçülen nM. Son derece yüksek benzeşim (KD < 500 pM), rakip DNA konsantrasyonları düşük seviyelerde (< 100 nM) ölçüm yanlışlıklar nedeniyle standart rekabetçi titrasyon (Şekil 5) kullanın.
HiP-FA neredeyse herhangi bir standart üzerinde uygulanan, ters, otomatik bir XY sahne ve bir piezo z ekseni sahne kullanılabilirliği sağlanan epifluorescence floresan mikroskop. Optik bileşenleri bir uzun mesafe amacı ile donatılmış bir otomatik widefield Kur etrafında inşa edilmiştir. Uygulamada, tahlil hedefleri ile diğer özelliklerini (belirli çalışma, mesafe ve sayısal diyafram) için adapte edilebilir. Ancak, bu parametrelerin optimizasyonu gerektirir ( zarasındaki mesafeleri-dilimler, porozite ve yükseklik özel jel, vs.). Diğer tür lazerler veya kamera kullanımı da mümkündür. Tüm deneysel bir işlem ve veri analizi ayrıntılı bir açıklaması aşağıda Protokolü bölümünde verilmiştir.
HiP-FA bağlama tercih manzara TF-DNA etkileşimlerin belirlenmesi için kapsamlı bir yeni yöntemidir. Bu bağlama benzeşim versiyonlarının bağlama tercihleri eşik yukarıda bağlayıcı kümesi nükleotit oluşum sıklığını yansıtılır herhangi bir temel varsayım kaçınarak mutational DNA motifi doğrudan, ölçer. Ölçüm çözüm immobilizasyon ve denge koşullarını mümkün olduğunca yaklaşıldığıdır bağlama tepki, mekanik ya da kimyasal müdahale olmadan gerçekleşir. Kontrollü teslimat sistemi ölçüm bir tam titrasyon eğrisi içinde tek bir de verir ve protein kaydedilirken performansı ve güvenilirliği artırmaktadır. Nesnel bir yüksek sayısal diyafram ve EM-CCD kamera ile yüksek ışık toplama verimliliği ile kullanma için son derece hassas floresan ışık algılama sağlar. Bu nedenle, bu kurulum ile düşük 10-15 mP doğru bir şekilde tespit edilebilir küçük SK değiştirir; uygulamada, bu demektir ki herhangi bir bağlama tepki için bağlama (düşük olarak 2 kitle oranında) en az sonra kitle artış kolayca algılanır. Bu genellikle Mikroplaka Okuyucular gibi ticari sistemleri ile durum böyle değil. Yüksek hassasiyeti nedeniyle, HiP-FA picomolar aralığına güvenilir bir şekilde ölçülebilir ayrılma sabitler aralığı genişletir. Bağlama enerjileri doğru bir şekilde birden fazla büyüklük belirlenir.
Gözden geçirilmiş PWMs kalitesini değerlendirmek için iki tür analiz20gerçekleştirilen. Test ettik segmentasyon gen ağ beş etmen için ne kadar iyi farklı PWMs deneysel ChIP-seq profilleri 21 segmentasyon genlerinin genomik bölgelerde tahmin edebilirsiniz. İkinci bir test olarak, segmentasyon arttırıcılar katılan TFs bağlama tercih ve protein konsantrasyonu temelinde ifade şekillerinin öngörür bir sıra ifade modeli4 kullandı. Her iki alýþtýrmalarda, daha az belirgin HiP-FA PWMs önemli ölçüde gerçekleştirmek bulduğumuz daha iyi daha belirgin footprinting ve B1H PWMs20.
De novo yöntemlerinden farklı olarak, HiP-FA bir verilen TF’ın bağlama tercih bazı ön bilgi gerektirir. Ancak, fikir birliği dizileri için birçok TFs bilinen ve birçok varolan Yöntem onları13,14,15temin edebilir. Gerekirse, gerçek en iyi bağlama sırası yinelemeli olarak bulunabilir.
Biz DNA başvuru reaksiyonlar fluorescently etiketli Cy5 ve Bodipy-650 ile kullanılır. Bu boyalar ilişkili ve ilişkisiz etiketli-başvuru DNA anizotropi yaşından beri farklı test edilmiş boyalar en büyük de FA ölçülerini gerçekleştirmek için kanıtlanmıştır. Bu maksimum dinamik aralığı için SK değerleri sağlar. Genel olarak, herhangi bir floresan boya ile floresan ömür boyu ≥ 1 ns ilk test gerekiyor uygun olması muhtemeldir. Mümkünse, bu protein autofluorescence en aza indirmek için yakın-IR aralığında Floresanda boya kullanmak için tavsiye edilir.
Deneysel işlemin en kritik adım jel iyi tabak içine pipetting olduğunu. İyi tekrarlanabilirlik jel birimleri olarak Tekdüzen olmasını gerektirir. Jel yükseklik değişiklikleri Yayınım rekabetçi DNA oligomer ve dolayısıyla benzeşme belirgin değişiklikleri değişiklikleri verileri değerlendirirken çevrilir. Bu teknik bir çoğaltma varyans ana kaynağıdır. Elektronik damlalıklı veya Otomasyon teknikleri tekrarlanabilirlik geliştirir. Hava kabarcıkları jel içinde yavaş ve dikkatli pipetting önlenebilir. Tüm rakip çözümleri ile titrasyon kuyu üstüne mümkün olduğunca küçük gecikme eklemek önemlidir. En iyi tekrarlanabilirlik için tüm süreç İnkübatörler ile pipetting bir robot kullanarak otomatik hale getirilebilir. Otomasyon için protokol aktarmak için önemli bir kuluçka sıcaklık gerekli optimizasyonu ve kuluçka süreleri parçasıdır. Viskozite jel arasındaki en iyi dengeyi bulmak emin olun (i.e. çok soğuk,) ve istikrar proteinlerin (Yani, çok sıcak değil). Bu ikisi de bağlıdır jelleri dağıtım hızı kullanılan protein kararlılığını ve kuyu içine üzerinde.
HiP-FA rakip DNA reaksiyonlar için kontrollü teslimat sistemi kullanır. Titrations eğriler oluşturmak için verilen her zrakip DNA toplama c(z,t) belirlemek gereklidir-pozisyon jel matris içinde ve zaman noktası t. KDs belirlenmesi doğrudan c(z,t)üzerinde bağlı olduğundan bu başka bir önemli adımdır. DNA toplama için sensör olarak NB boya içeren kalibrasyon wells (Şekil 1d, Şekil 2bir) bu amaç için kullanılır. Genellikle, 3-5 kalibrasyon wells NB plaka içeren yeterlidir. Herhangi bir HiP-FA değerlendirmeden önce deneme, NB kalibrasyon eğrisi kurulum için bir rakip DNA’sı farklı konsantrasyonlarda (Şekil 3 herhangi bir sıra ile özel jel içinde çözünmüş NB geleneksel titrasyon dizi gerçekleştirerek inşa edilmelidir bir), ayrıntılı 8. adımda açıklandığı gibi. Çok güçlü bağlama durumunda (KD < 500 pM), düşük konsantrasyonlarda rakip DNA tayini için kullanılan ekstrapolasyon sınırlama, ondan beri onun'daha az doğrudan bir ölçüm daha doğru olur. Ancak, böyle düşük KDs ile TFs için HiP-SK kurulumu geleneksel bir rekabetçi titrasyon bağlama arabellek bir özel jel matris (Şekil 5) kullanmaya gerek kalmadan gerçekleştirmek için kullanılabilir. Örneğin, bir tam titrasyon rakip DNA 12 farklı konsantrasyonları ile 96-şey plaka tek bir satır olarak gerçekleştirilebilir.
Özel jel rağmen (yavaş) dinamik olmasına rağmen kontrollü teslimat sistemi beri difüzyon hızlı TF-DNA bağlayıcı kinetik ve istikrarlı proteinler de gerektirir. Her iki özelliği doğrudan HiP-SK kurulumu ile yanında tabi, zaman, ne zaman kendi için başvuru DNA fluorescently etiketli bağlı faiz TFs SK içinde test edilebilir. KON ve KOFF oranları incelenen faktörleri için ölçülen ve saniye20, uygun olarak diğer çalışmalar30milisaniye sırasına gördüm. Bu ölçümler denge yerde almak emin olmak için yeterince hızlı. Yavaş kinetik diğer bağlayıcı etki söz konusu olduğunda, rakibin Yayınım onun konsantrasyonu düşürülmesi veya jel gözenek boyutunu küçültmeyi ayarlanabilir. Test TFs söz konusu olduğunda, tüm hızlı Tkapalı olması (~ saniye), toplam ölçüm yaklaşık 1-2 h her ölçüm, termodinamik denge sağlamak için yeterli zamanı.
Protein ile ilgili başka bir olası sorun SK ölçümleri değiştirebilir protein toplamları oluşumdur. (Tensides gibi) farklı katkı maddeleri içeren diğer tampon koşulları kullanım toplama oluşumu, gerekirse engelleyebilirsiniz.
PWM doğrusallık varsayımı altında çalıştım; Ancak, HIP-FA tüm olası di-nükleotit mutasyonlar fikir sırasının içerecek şekilde ölçeklenebilir. Son olarak, HiP-FA diğer tip-in bağlama etkileşimleri ölçmek için adapte edilebilir. İçin önkoşuldur kullanılabilir uygun başvuru molekül bağlı fluorescently etiketli protein tarafından. Kontrollü iletim sistemi ile her türlü ligand için konsantrasyon gradyanı oluşturulabilir; Bu nedenle, protein-protein ve uyuşturucu-protein etkileşimleri benzer şekilde yüksek sadakat ve işlem hacmi ile ölçülebilir.
The authors have nothing to disclose.
J. Müller, değerli tavsiyeler ve ruhlu tartışma cDNA klonlar ve Galya laboratuarda özellikle S. Bergelt üyeleri için teşekkür ediyoruz. Bu eser SFB 646, genom ifade ve bakım (C.J., P.B.), tümleşik Protein bilim (U.G.) için merkezi ve Enstitü nicel Biosciences Münih (M.S.) için düzenleyici ağları tarafından desteklenmiştir. U.G. kabul eder Bundesministerium für Bildung und Forschung (SFB 646, SFB 1064, CIPSM, QBM) tarafından Deutsche Forschungsgemeinschaft destek (BMBF: efe – Innovationswettbewerb Systembiologie) ve Humboldt Vakfı (Alexander von Humboldt, Profesörlük).
Cy5-labled 16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
16- / 18-bp DNA-oligomers | Eurofins | Custom synthesis | |
Nile Blue A | Sigma | N5632-25G | |
Sensoplate plus microplate 96- or 384-well, PS | Greiner | 655891 | 175 µm thick glass bottom |
384 Well Sensoplate, black | Greiner | 788896 | |
Agarose, low gelling temperature | Sigma | A9414-50G | |
Sodium Chloride | Merck | 1.06404.1000 | |
Tween-20 | Sigma | P1379-1L | |
Di-Potassium hydrogen phosphate trihydrate | Merck | 1.05099.1000 | |
Potassium dihydrogen phosphate | Merck | 1.04873.1000 | |
Q-POD Element | Merck Millipore | ZMQSP0DE1 | |
Millipak 40 Gamma Gold Filter | Merck Millipore | MPGL04GK2 | |
Milli-Q Integral 3 Water Purification System | Merck Millipore | ZRXQ003WW | |
Quantum TIX | Merck Millipore | QTUMOTIX1 | |
DL-Dithiothreitol | Sigma | 43815-1G | |
Mastercycler gradient | Eppendorf | Z316083 | |
SafeSeal tube 1.5 mL | Sarstedt | 72.706.200 | |
Tube 15 mL | Sarstedt | 62.554.502 | |
Multiply-Pro cup 0.2 mL PP | Sarstedt | 72.737.002 | |
MICROSCOPY SETUP: | |||
Automated widefield microscope | LEICA | DMI6000 | |
Long distance objective | LEICA | HCX PL FLUOAR L 60x/0.60 N.A. Dry | |
638 nm line continuous diode laser | Omicron | PHOxX 638-40, 40mW | |
Back-illuminated EM-CCD Camera | Andor | iXon DV897 | |
Dichroic mirror | AHF | 640nm cut-off | |
Bandpass filter | AHF | ET bandpass 700/75 | |
Linear polarizer | Thorlabs | LPVISC050-MP2 | |
Polarizing beam splitter | Thorlabs | BS010 | |
Achromatic lens | Thorlabs | 200 mm focal length | |
Multimode optical fiber | Optronis | FVP600660710 | |
ROBOTIC SYSTEM: | |||
Our robotic system includes a Biomek NXP workstations with a 96-channel head and with Span-8 pipettors, connected with a servo-shuttle, are used for all liquid transfer steps. In addition, the system is equipped with orbital shakers and a microplate reader (Paradigm, Molecular device) served by the Span-8 gripper | Beckman Coulter | Biomek NXP | |
SOFTWARE: | |||
Programming language | National Instruments | Labview 9.0 | |
Script for the HiP-FA software available at | https://github.com/GeneCenterMunich/HiP-FA |