Utilizando mayor expresión de proteína de fluorescencia verde Escherichia Coli evaluar fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón
概要
Aquí, presentamos un protocolo para evaluar la fagocitosis de macrófagos peritoneales de ratón usando la fluorescencia verde mayor expresando proteínas de Escherichia coli.
Abstract
Este manuscrito describe un método simple y reproducible para realizar un ensayo de fagocitosis. La primera parte de este método implica la construcción de un vector pET-SUMO-EGFP (SUMO = pequeño ubiquitin-like modifier) y expresión de la proteína de fluorescencia verde (EGFP) en Escherichia coli (BL21DE). Expresión de EGFP e. coli es coincubated con los macrófagos por 1 h a 37 ° C; el grupo control negativo se incuba en hielo para la misma cantidad de tiempo. Entonces, los macrófagos están listos para la evaluación. Las ventajas de esta técnica incluyen sus pasos sencillo y fagocitosis puede ser medida por ambos microscopio de flujo citómetro y fluorescencia. La expresión de EGFP e. coli son estables y mostrar una señal de fluorescencia fuerte incluso después de que los macrófagos son fijados con paraformaldehido. Este método no sólo es adecuado para la evaluación de las líneas celulares de macrófagos o macrófagos primarios en vitro pero también conveniente para la evaluación de la fagocitosis de granulocitos y monocitos en células mononucleares de sangre periférica. Los resultados muestran que la capacidad fagocitaria de los macrófagos peritoneales de ratones jóvenes (ocho semanas de edad) es mayor que la de los macrófagos de ratones (16 meses de edad) años de edad. En Resumen, este método mide la fagocitosis de macrófagos y es conveniente para estudiar la función del sistema inmune innato.
Introduction
Ensayos de fagocitosis del macrófago se utilizan a menudo para el estudio de la función inmune innata. La respuesta inmunitaria innata puede indicar susceptibilidad a la infección. Líneas celulares de macrófagos son ampliamente utilizadas en estudios de Inmunología. Sin embargo, el paso extendido puede causar la pérdida de gene y compromete las funciones inmunológicas en estas líneas celulares. Así, los macrófagos peritoneales primarios son el objeto ideal para estudiar la función de células1.
Aunque fue probablemente intacto en el cuerpo de la respuesta inmunitaria innata, la capacidad fagocítica puede disminuir con respecto a que en el más joven del cuerpo2,3. Aquí le mostraremos un método para evaluar la fagocitosis de los macrófagos peritoneales de jóvenes (8 semanas de edad) y el ratón de edad (16-month-old) con expresión de EGFP e. coli, que es conveniente, rápida y económicamente factible.
El uso de una cepa de expresión de EGFP e. coli es una de las ventajas de este ensayo ya que estas bacterias son estables y mostrar una señal de fluorescencia fuerte, incluso después de que los macrófagos son fijos por paraformaldehído al 4% (w/v). Además, mediante el uso de la expresión de EGFP e. coli, los investigadores no necesitan tinción más después de la fagocitosis, que ahorra tiempo. Además, los macrófagos son immunoresponsive para el antígeno de superficie de e. coli , lo que e. coli más adecuado para el ensayo de fagocitosis que el uso de la expresión de EGFP hongos o granos marcados con fluoresceína.
Con expresión de EGFP e. coli, un ensayo de fagocitosis puede ser fácilmente realizado en 2 h y medido por tanto flujo cytometry y fluorescencia microscopía, dependiendo del propósito del investigador. Puesto que este método mide directamente la capacidad fagocítica, los resultados son más reproducibles que otros métodos indirectos.
Este método ha sido validado también en una línea de 264.7 células y células de sangre periférica mononuclear4. El texto siguiente proporciona las instrucciones detalladas paso a paso para realizar este análisis y destaca los pasos críticos que los investigadores pueden modificar para satisfacer las necesidades de sus experimentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos de este protocolo están muy simple y sencilla. Uno de los pasos críticos es inducir la expresión de EGFP en e. coli. Generalmente, cuando un gen de eucariotes, como EGFP, está previsto expresar en procariotes como la e. coli, existe el riesgo de que la proteína forma agregados inactivos (cuerpos de inclusión), que cambia la estructura nativa de la proteína y la actividad. Utilizando el vector pET-SUMO y construyendo el plásmido pET-SUMO-EGFP, la proteína de la fusión de EGFP-SUMO exp…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La Fundación Nacional de Ciencias naturales de China (Nº 31800046) y la Fundación Ciencias naturales de la provincia de Liaoning (Nº 20170540262) apoyan este trabajo. Este trabajo fue realizado en los laboratorios del centro de investigación científica en el segundo Hospital de Dalian Medical University. Los autores desean agradecer a Xiao-Lin Sang su asistencia con la citometría de flujo y Bo Qu y Dong Chuan Yang por su asistencia en la producción de vídeo.
Materials
| BD FACSCanto II Flow cytometer | BD Biosciences | – | |
| Biotin anti-mouse CD16/32 Antibody | Biolegend | Cat101303 | |
| Champion pET SUMO Protein Expression system | Invitrogen | K300-01 | |
| Custom Gene Synthesis Service | Takara Biotech. | – | |
| DAPI(4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | ThermoFisher | D1306 | |
| F4/80-PE anti-mouse antibody for FACS | Biolegend | Cat123110 | |
| Leica DMI3000 B Inverted Microscope | Leica Microsystems | – | |
| PE Rat IgG2a, κ-isotype control | Biolegend | Cat400507 | |
| Phalloidin 633 fluorescence dye conjugated working solution | AAT Bioquest | Cat23125 | |
| Thioglycollate medium | Sigma-Aldrich | T9032 |
参考文献
- Layoun, A., Samba, M., Santos, M. M. Isolation of murine peritoneal macrophages to carry out gene expression analysis upon Toll-like receptors stimulation. Journal of Visualized Experiments. 98, e52749 (2015).
- Iskander, K. N., et al. Sepsis: multiple abnormalities, heterogeneous responses, and evolving understanding. Physiological Reviews. 93 (3), 1247-1288 (2013).
- Girard, T. D., Opal, S. M., Ely, E. W. Insights into severe sepsis in older patients: from epidemiology to evidence-based management. Clinical Infectious Diseases. 40 (5), 719-727 (2005).
- Bicker, H., et al. A simple assay to measure phagocytosis of live bacteria. Clinical Chemistry. 54 (5), 911-915 (2008).
- Zhou, M. Y., Gomez-Sanchez, C. E. Universal TA cloning. Current Issues in Molecular Biology. 2 (1), 1-7 (2000).
- Chen, Q., et al. Triggering receptor expressed on myeloid cells-2 protects against polymicrobial sepsis by enhancing bacterial clearance. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 188 (2), 201-212 (2013).
- Lamberti, G., de Araujo, M. E., Huber, L. A. Isolation of Macrophage Early and Late Endosomes by Latex Bead Internalization and Density Gradient Centrifugation. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2015).
- Miksa, M., Komura, H., Wu, R., Shah, K. G., Wang, P. A novel method to determine the engulfment of apoptotic cells by macrophages using pHrodo succinimidyl ester. Journal of Immunological Methods. 342 (1-2), 71-77 (2009).
- Weingart, C. L., et al. Fluorescent labels influence phagocytosis of Bordetella pertussis by human neutrophils. Infection and Immunity. 67 (8), 4264-4267 (1999).
- Neaga, A., Lefor, J., Lich, K. E., Liparoto, S. F., Xiao, Y. Q. Development and validation of a flow cytometric method to evaluate phagocytosis of pHrodo BioParticles(R) by granulocytes in multiple species. Journal of Immunological Methods. 390 (1-2), 9-17 (2013).
- Ninkovic, J., Roy, S. High throughput fluorometric technique for assessment of macrophage phagocytosis and actin polymerization. Journal of Visualized Experiments. (93), e52195 (2014).
