Este protocolo descreve os processos gerais e controle de qualidade verifica necessário para a preparação de células simples mamíferos adultas saudáveis para preparações de RNA-Seq de célula única baseada em gotículas, alta taxa de transferência. Parâmetros de sequenciamento, alinhamento de leitura e análise de bioinformatic a jusante de célula única também são fornecidos.
A análise da expressão gênica de célula única através de milhares de células individuais dentro de um tecido ou microambiente é uma ferramenta valiosa para identificar composição celular, discriminação dos Estados funcionais e vias moleculares subjacentes observado tecido funções e comportamentos animais. No entanto, o isolamento de células única intactas e saudáveis de tecidos de mamíferos adultos para análise molecular subsequente a jusante única célula pode ser um desafio. Este protocolo descreve os processos gerais e controle de qualidade verifica necessário para obter preparações de alta qualidade adulto única célula do sistema nervoso ou pele que permitiu análise e sequenciamento de célula única imparcial subsequentes do RNA. Diretrizes para a análise de bioinformatic jusante também são fornecidas.
Com o desenvolvimento da alta taxa de transferência única célula tecnologia1,2 e avanços em ferramentas de Bioinformática amigável ao longo da última década3, surgiu-se um novo campo de análise de expressão do gene de alta resolução – sequenciamento de RNA de célula única (scRNA-Seq). O estudo da expressão gênica de célula única foi desenvolvido para identificar heterogeneidade dentro de populações de células definidos, tais como em células estaminais ou células cancerosas, ou para identificar raras populações de células4,5, que estavam usando inatingível técnicas de sequenciamento de RNA em massa tradicional. Ferramentas de Bioinformatic permitiram a identificação de sub-populações romance (Seurat)2, visualização da ordem de células ao longo de um psuedotime espacial (monóculo)6, definição das redes de sinalização ativas dentro ou entre populações ( CÊNICA)7, predição da Assembleia do único-células em um espaço 3D artificial (Seurat e muito mais)8. Com estas análises novas e excitantes disponíveis para a comunidade científica, scRNA-Seq é rápido, tornando-se a nova abordagem padrão para análise de expressão do gene.
Apesar do vasto potencial de scRNA-Seq, skillsets técnicos necessários para produzir um conjunto de dados limpo e com precisão, interpretar resultados pode ser um desafio para os recém-chegados. Aqui, um protocolo básico, mas abrangente, a partir do isolamento de células únicas de tecidos todo primários para visualização e apresentação de dados para publicação é apresentada (Figura 1). Em primeiro lugar, o isolamento de células saudáveis único pode ser considerado desafiador, como tecidos diferentes variam em seu grau de sensibilidade à digestão enzimática e subsequente dissociação mecânica. Este protocolo fornece orientação nessas etapas de isolamento e identifica os pontos de verificação de controle de qualidade importante durante todo o processo. Em segundo lugar, a compreensão da compatibilidade e requisitos entre tecnologia única célula e sequenciamento de próxima geração pode ser confuso. Este protocolo fornece diretrizes para implementar uma plataforma amigável, baseada em gotículas barcoding monocelulares e realizar o sequenciamento. Finalmente, programação de computadores é um requisito importante para a análise de conjuntos de dados transcriptomic de célula única. Este protocolo fornece recursos para começar com a linguagem de programação R e fornece orientação sobre como implementar dois pacotes de R populares scRNA Seq-específicos. Juntos, este protocolo pode orientar os recém-chegados na realização de análises scRNA-Seq para a obtenção de resultados claros, interpretáveis. Este protocolo pode ser ajustado para a maioria dos tecidos no mouse e importante poderia ser modificado para uso com outros organismos, incluindo o tecido humano. Ajustes dependendo do tecido e do usuário serão necessários.
Há várias considerações a ter em mente ao seguir este protocolo; incluindo, 1) seguir todas as diretrizes de controle de qualidade nas etapas 1 e 2 do presente protocolo é recomendado para garantir uma suspensão de célula única viável de todas as células dentro da amostra de interesse, assegurando a contagem de número de células de total exato (resumidas em Figura 2 ). Uma vez que este é alcançado, e se forem seguidas todas as condições otimizadas, as etapas de controle de qualidade podem ser descartadas (para economizar tempo – preservar a qualidade do RNA e redução de células perda). Confirmando o sucesso isolamento de células únicas de alta viabilidade do tecido de interesse é altamente recomendo antes de qualquer um jusante de processamento. 2) uma vez que alguns tipos de células são mais sensíveis do que outros ao estresse, técnicas de dissociação excessiva podem inadvertidamente viés da população, confundindo, portanto, a análise a jusante. Dissociação suave sem ruptura celular desnecessários e digestão é fundamental para alcançar altos rendimentos de celulares e uma representação exata da composição do tecido. Forças de cisalhamento ocorrem durante as etapas de trituração, FACS e ressuspensão. 3) como com qualquer trabalho de RNA, é melhor introduzir como RNase adicional pequeno da amostra quanto possível durante a preparação. Isto ajudará a manter a qualidade do RNA. Utilizar soluções de inibidor do ribonuclease com lavagem de ferramentas limpas e qualquer equipamento que não é livre de RNase mas Evite produtos DEPC tratada. 4) realize preparações tão rapidamente quanto possível. Isto ajudará a manter a qualidade do RNA e reduzir a morte celular. Dependendo do comprimento de dissecação de tecido e o número de animais, considere começar várias dissecações ou preparações ao mesmo tempo. 5) prepare células no gelo quando possível para manter a alta qualidade do RNA, reduzir a morte celular e lenta atividade transcricional e sinalização de células. Embora, processamento gelado é ideal para a maioria dos tipos de células, alguns tipos de células (por exemplo, os neutrófilos) melhor desempenho quando processado à temperatura ambiente. 6) Evite o cálcio, magnésio, EDTA e tratada com DEPC produtos durante a preparação da célula.
Este protocolo demonstra como a preparação adequada de células únicas pode descobrir a heterogeneidade transcriptional de milhares de células únicas e discriminar Estados funcionais ou identidades únicas de celulares dentro de um tecido. O protocolo não exige ferramentas transgénicas ou proteínas fluorescentes repórter e pode ser aplicado para o isolamento de células únicas de diversos tecidos de interesse, incluindo os de seres humanos; tendo em mente cada tecido é único e este protocolo exigirá algum grau de adaptação/modificação.
Os programas transcriptional diversificados e altamente dinâmicos dentro de células têm enfatizado o valor da célula única genómica. Além de isolar o RNA de alta qualidade, uma etapa de preparação de amostra crítico necessária para conjuntos de dados de alta qualidade é garantir que as células são completamente liberadas do tecido e que as células são saudáveis e intacta. Isto é relativamente direta para coleta de células que são facilmente lançou, como circulantes de células ou tecidos onde as células são frouxamente retidas, como em tecidos linfoides. Mas isso pode ser um desafio para outros tecidos adultos, devido à arquitetura celular altamente desenvolvidos, abrangendo grandes distâncias, em torno da matriz extracelular e as proteínas do citoesqueleto rígida frequentemente envolvidos na manutenção da estrutura celular. Mesmo com técnicas de dissociação apropriado para a versão completa de células, há um potencial que o rigoroso e muitas vezes demorado processamento necessário alteraria a integridade de qualidade e celular mRNA. Além disso, as altas temperaturas, utilizadas para dissociação enzima assistida também afetam assinaturas transcriptional29,30. A intenção do protocolo é apresentar controle de qualidade verifica, usando tecidos tais como o nervo adulto mielinizado e a pele de adulta ricos em matriz extracelular, para demonstrar como a otimização pode ajudar a superar esses obstáculos.
Uma consideração importante ao projetar qualquer experimento scRNA-Seq é a escolha de profundidade de sequenciamento. Sequenciamento pode ser altamente multiplexado e ler profundidade pode variar sendo muito baixo usando Drop-Seq2 para até 5 milhões de leituras/célula14 usando um método de RNA-Seq completo como Smart-Seq A maioria dos experimentos de scRNA-Seq podem detectar transcrições de moderada a alta expressão com sequenciamento tão baixo quanto 10.000 leituras/célula, que é geralmente suficiente para4241,classificação do tipo celular. Sequenciamento superficial profundidade é de valor para economizar em custos de sequenciamento ao tentar detectar populações de células raras em tecidos complexos, onde milhares de células podem ser necessários para confiantemente atribuem populações raras. Mas o sequenciamento de profundidade não é adequado quando são necessárias informações detalhadas na expressão dos genes e processos associados com assinaturas transcriptional sutis. Atualmente, estima-se que a grande maioria dos genes em uma célula é detectada com 500.000 leituras/célula, mas isso pode variar dependendo do protocolo e tecido tipo43,44. Enquanto transcrição completos no sequenciamento contorna a necessidade de montagem e pode, portanto, detectar romance ou variantes raras da tala, custos de sequenciamento frequentemente limitam a escala tais abordagens para examinar milhares de células que inclui um sistema complexo de tecido. Em contraste, 3′ com a tag bibliotecas unicelulares tais como as descritas neste protocolo normalmente têm baixa complexidade e exigem mais raso sequenciamento. É importante notar que bibliotecas geradas usando o protocolo descrito podem ser sequenciadas em uma das cinco sequenciadores suportados: 1) NovaSeq, 2) HiSeq 3000/4000, 2500 3) HiSeq execução rápida e alta saída, 4) NextSeq 500/550 e MiSeq 5).
Uma abordagem alternativa a única célula RNA-Seq, que reduz a necessidade de tecidos delicados e célula manipulação ainda mantém alguns dos benefícios da única célula RNA-Seq, é a análise do RNA do núcleo único45. Esta abordagem permite o processamento mais rápido, reduzindo a degradação do RNA e tomar medidas mais drásticas para garantir a adequada liberação de núcleos e assim provavelmente permite uma captura mais confiante dos perfis transcriptional que representa todas as células dentro de um determinado tecido. Isto, claro, só forneceria uma porção da atividade transcricional presente dentro de uma determinada célula, assim, dependendo de quais objetivos experimentais são de interesse, esta abordagem pode ou não ser adequado.
Além a caracterização completa de identidades celulares dentro de um determinado tecido, uma das mais valiosas análises para conjuntos de dados scRNA-Seq é a avaliação de Estados intermediários transcriptional em populações de células ‘definido’. Estes Estados intermediários podem dar insights sobre as relações de linhagem entre células dentro das populações identificadas, que não foi possível com a tradicional massa que se aproxima do RNA-Seq. Várias ferramentas de bioinformatic scRNA-Seq agora foram desenvolvidas para elucidar isso. Tais ferramentas podem avaliar os processos envolvidos em, por exemplo, as células cancerosas em transição para um estado oncogênica/metastático, células-tronco amadurecimento em diversos destinos terminais ou células imunitárias vaivém entre os Estados ativos e inativo. Transcriptoma sutis diferenças nas células também podem ser indicativas de enviesamentos de linhagem que, ferramentas de bioinformatic recentemente desenvolvidos como FateID, pode inferir47. Uma vez que as distinções entre as células de transição podem ser difícil verificar tendo em conta as diferenças transcriptional pode ser sutil, sequenciamento mais profundo pode ser necessário46. Felizmente, a cobertura de uma biblioteca superficialmente sequenciada pode ser aumentada se interessado na investigação do conjunto de dados mais re-executando a biblioteca na outra célula de fluxo.
Tomados em conjunto, este protocolo fornece um fácil-para-adaptar-se de fluxo de trabalho que permite aos usuários transcricionalmente perfil centenas ou milhares de single-células dentro de um experimento. A qualidade final de um conjunto de dados de scRNA-Seq baseia-se no isolamento de célula otimizado, citometria de fluxo, geração de biblioteca de cDNA e interpretação de matrizes gene cru-código de barras. Para este fim, este protocolo fornece uma visão abrangente de todas as etapas-chave que pode ser facilmente modificado para permitir estudos de tipos diversos de tecido.
The authors have nothing to disclose.
Reconhecemos que o pessoal de apoio à instalação de serviços de UCDNA, bem como o pessoal de instalação Cuidado Animal na Universidade de Calgary. Agradecemos a Matt Workentine para seu apoio de bioinformática e Jens Durruthy para seu suporte técnico. Este trabalho foi financiado por um subsídio CIHR (R.M. e J.B.), um CIHR New Investigator Award, J.B., e saúde Research Institute Fellowship (J.S. uma infantil de Alberta).
Products | |||
RNAse out | Biosciences | 786-70 | |
Pentobarbital sodium | Euthanyl | 50mg/kg | |
HBSS | Gibco | 14175-095 | |
Dispase 5U/ml | StemCell Technologies | 7913 | 5 mg/ml |
Collagenase-4 125 CDU/mg | Sigma-Aldrich | C5138 | 2 mg/ml |
DNAse | Sigma-Aldrich | DN25 | 10mg/ml |
BSA | Sigma-Aldrich | A7906 | |
15 ml Narrow bottom tube VWR® High-Performance Centrifuge Tubes | VWR | 89039-666 | |
Sytox Orange Viability Dye | Molecular Probes | 11320972 | 1.3 nM/µl |
Nuc Blue Live ReadyProbes | Invitrogen | R37605 | |
Agilent Bioanalyzer High senitivity DNA Reagents | Agilent | 5067-4626 | |
Kapa DNA Quantification Kit | Kapa Biosystems | KK4844 | |
Equipment | |||
BD FACSAria III | BD Biosciences | ||
Agilent Bioanalyzer Platform | Agilent | ||
Illumina® HiSeq 4000 | Illumina | ||
Illumina® MiSeq SR50 | Illumina | ||
Software | |||
The Cell Ranger | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/overview/welcome | |||
Loupe Cell Browser | 10x GENOMICS | support.10xgenomics.com/single-cell-gene-expression | |
/software/downloads/latest | |||
R | https://anaconda.org/r/r |