Effets du goût signalisation suppression de protéine sur l’Inflammation intestinale dans un modèle de souris de la maladie inflammatoire de l’intestin
概要
Nous présentons ici un protocole pour étudier l’effet de l’invalidation des gènes reliés à la gustation sur les réponses immunitaires dans un sodium de sulfate de dextran (DSS)-induit le modèle de souris de maladie inflammatoire de l’intestin.
Abstract
Maladies inflammatoires de l’intestin (MII) est l’un des troubles gastro-intestinaux liées, y compris la colite ulcéreuse et la maladie de Crohn, qui affecte la qualité de vie de millions de personnes dans le monde. Les symptômes de l’IBD comprennent des douleurs abdominales, la diarrhée et des saignements rectaux, pouvant résulter de l’interaction entre microbiote intestinal, des composants alimentaires, les cellules épithéliales intestinales et cellules immunitaires. Il est particulièrement important d’évaluer comment chaque gène clé exprimé dans les cellules épithéliales et immunitaires intestinales affecte l’inflammation du côlon. Les récepteurs de goût couplés aux protéines G, y compris G protéine sous-unité α-gustducin et autres protéines de signalisation, ont été trouvés dans les intestins. Ici, nous utilisons des α-gustducin en tant que représentant et décrire un sodium de sulfate de dextran (DSS)-induite par le modèle DCI pour évaluer l’effet des mutations du gène gustatif sur immunité mucosale intestinale et l’inflammation. Cette méthode combine la technologie génique knockout avec le modèle DCI induit chimiquement et ainsi peut être appliquée pour évaluer le résultat de l’annulation par le gène gustatif, mais aussi les autres gènes qui peuvent exuberate ou humidifier la réponse immunitaire induite par le DSS dans le côlon. Des souris mutantes sont administrés avec DSS pendant une certaine période au cours de laquelle leur poids corporel, selles et saignements rectaux sont surveillés et enregistrés. À différents intervalles au cours de l’administration, certaines souris sont euthanasiés, puis les dimensions et le poids de leurs spleens et deux-points sont mesurés et les tissus de l’intestin sont collectées et traitées pour histologique et analyses d’expression génique. Les données montrent que les résultats de knockout α-gustducin en perte de poids excessive, diarrhée, hémorragies intestinales, des lésions tissulaires et inflammation vs sauvage souris. Puisque la gravité de l’inflammation induite est affectée par les souches de souris, habitat et l’alimentation, l’optimisation de la durée de concentration et de l’administration DSS dans une expérience pilote est particulièrement importante. En réglant ces facteurs, cette méthode peut être appliquée afin d’évaluer les effets anti – et pro-inflammatoires.
Introduction
Les deux principales formes de la maladie intestinale inflammatoire (MII), maladie de Crohn (MC) et la colite ulcéreuse (Cu) sont caractérisés par rémittentes ou progressives inflammatoires chroniques de l’intestin avec étiologie multifactorielle1,2 . Le développement des MICI dépend de la génétiques ainsi que certains facteurs environnementaux comme l’alimentation, l’utilisation des antibiotiques et surtout, les infections pathogènes. Toutefois, l’étiologie et la réglementation mécanismes moléculaires de l’IBD sont encore peu claires. Par conséquent, nombreux modèles animaux induites chimiquement de DCI ont été construits et appliquées pour délimiter la pathogenèse et les mécanismes de régulation et d’évaluer l’efficacité de la thérapeutique humaine3.
Récepteurs gustatifs sont des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) et sont classées dans deux grands types : type I (T1Rs), et type II (T2Rs) qui détectent les composés amers, sucrée et umami. Cascades de signalisation de goût sont initiées par tastant T1Rs ou T2Rs, activant la heterotrimeric G protéines liantes consistant α-gustducin et un dimère Gβγ et conduisant à la libération des sous-unités Gβγ. La portion Gβγ stimule à son tour l’effecteur enzyme phospholipase C-β2 (PLC-β2). PLC-β2 activés puis hydrolyse le phosphatidylinositol-4, 5-bisphosphate en deux messagers secondaires intracellulaires [l’inositol 1,4,5-trisphosphate (IP-3) et le diacylglycérol] et IP3 se lie à et ouvrir son canal-récepteur IP3 R3, libérant des ions de calcium du réticulum endoplasmique. Cela conduit finalement à l’ouverture du canal ionique potentiel de récepteur transitoire Trpm5 et la libération de l’ATP de neurotransmetteur sur les nerfs gustatifs4,5,6,7. Pourtant, les voies de signalisation de goût aigre et salé sont différentes et indépendantes du sucré, umami et amertume8. En outre, les composants du goût RCPG et aval protéines existent dans divers tissus extra-orale. Des études récentes ont indiqué que α-gustducin, la principale composante de la signalisation de goût, se trouve à s’exprimer dans la muqueuse intestinale. D’autres études sont nécessaires pour comprendre les fonctions de ces goût signalisation composants en tissus extra-orale9,10.
La méthode décrite ici est utilisée pour caractériser les fonctions des protéines signalisation gustatives exprimées dans les tissus extra-orale. Nous combinons une lignée de souris transgéniques développée pour délimiter des cascades de signalisation dans les papilles avec le modèle de colite induite chimiquement. En grande partie en raison de sa simplicité procédurale et similitudes pathologiques à la colite ulcéreuse humaine, le dextran sulfate de sodium (DSS)-induite DCI modèle a été utilisé plus largement parmi les divers colite induite chimiquement modèles11. Dans cette étude, nous avons utilisé des α-gustducin-deficient mice comme une lignée de souris représentant pour révéler les nouvelles fonctions des α-gustducin en immunité mucosale intestinale et l’inflammation en 1) analysant les changements morphologiques dans les tissus et 2) analyse les différences dans l’expression de cytokines liées à l’inflammation du côlon. Cette méthode peut être utilisée pour quantitativement et qualitativement déterminer la contribution des protéines de signalisation gustatifs (et autres protéines exprimées dans le tube digestif) à des lésions tissulaires et de l’inflammation intestinale, quand les lignes pour les gènes de souris génétiquement modifiée intérêt sont disponibles. Avantages de cette méthode permettent aux utilisateurs d’obtenir des données intégrées résultant d’actions de la DSS chimique et la déficience du gène d’intérêt. Cette méthode peut encore être améliorée pour augmenter sa sensibilité et de révéler des changements subtils intestinaux au niveau cellulaire et moléculaire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette méthode peut être utilisée pour quantitativement déterminer l’effet de mutations des gènes gustatives spécifiques sur l’inflammation dans un modèle murin d’EIA induite par le DSS. Pour tirer pleinement parti, induction optimale des MICI est une étape clé. Le développement de la colite est affecté par plusieurs facteurs, dont la souche de souris, habitat, la microflore intestinale, ainsi que les gènes d’intérêt. Il est recommandé d’effectuer une expérience pilote avec un petit nombre de sou…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail est soutenu par des subventions de la Fondation de Sciences naturelles nationales de la Chine (81671016, 31471008 et 31661143030) et le National Institutes of Health (DC010012, DC015819) et par la Fondation d’éléments.
Materials
| Antibody | |||
| CD45 | BD Biosciences | 550539 | |
| CD3 | BD Biosciences | 555273 | |
| B220 | BD Biosciences | 550286 | |
| CD11b | BD Biosciences | 550282 | |
| Ly6G | BD Biosciences | 551459 | |
| Reagent | |||
| Dextran Sulfate Sodium Salt (DSS) | MP Biomedicals | 2160110 | |
| Streptavidin-HRP complex | BD Pharmingen | 551011 | |
| H&E Staining Kit | BBI Life Sciences | E607318 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sangon Biotech | B548117 | |
| FastStart Universal SYBR Green Master(ROX) | Roche | 4913850001 | |
| MMLV Reverse Transcriptase, GPR | Clontech,TaKaRa | 639574 | |
| TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit | TaKaRa | 9767 | |
| BD 10 ml Syringe | BD Biosciences | 309604 | |
| Instruments and equipment | |||
| balance | |||
| scissors | |||
| forceps | |||
| centrifuge | |||
| qPCR machine | |||
| staining jars | |||
| Software | |||
| Imag-Pro Plus | Media Cybernetics, Inc. | ||
参考文献
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