ميكرورنا الرئة "التنميط عبر الشبقية دورة" في الفئران المعرضة للأوزون
概要
هنا يمكننا وصف أسلوب تقييم التعبير الرئة من ميرناس التي من المتوقع لتنظيم الجينات التحريضية استخدام الفئران المعرضة للأوزون أو تصفية الهواء في مراحل مختلفة من دورة الشبقية.
Abstract
التنميط ميكرورنا (ميرنا) أصبحت ذات الأهمية للباحثين العاملين في مختلف مجالات البحوث في علم الأحياء والطب. وتبين الدراسات الحالية واعدة مستقبلا من استخدام ميرناس في التشخيص ورعاية أمراض الرئة. هنا، علينا أن نحدد بروتوكول لميرنا التنميط لقياس الوفرة النسبية لمجموعة من ميرناس وتوقع لتنظيم الجينات التهاب في أنسجة الرئة من طراز الماوس التهاب مجرى الهواء الناجم عن الأوزون. لأنه قد ثبت أن تعميم مستويات هرمون الجنس يمكن أن تؤثر على تنظيم الحصانة الفطرية الرئة لدى الإناث، والغرض من هذا الأسلوب وصف ميرنا تحريضية التنميط البروتوكول في الفئران الإناث، آخذا في الاعتبار دورة الشبقية مرحلة كل حيوان في وقت التعرض للأوزون. ونحن أيضا معالجة النهج المعلوماتية المطبقة على ميرنا الاكتشاف والهدف التعرف على أساليب استخدام ليما، برنامج البحث والتطوير/بيوكوندوكتور، والمقترنة ببرامج التحليل الوظيفي لفهم السياق البيولوجي ومسارات التعبير ميرنا التفاضلية.
Introduction
ميكرورناس (ميرناس) هي قصيرة (19 إلى 25 النيوكليوتيدات)، تحدث بشكل طبيعي، غير الترميز جزيئات الحمض النووي الريبي. تسلسل ميرناس تطورية حفظت عبر الأنواع، مما يشير إلى أهمية ميرناس في تنظيم الوظائف الفسيولوجية1. ميكرورنا التعبير التنميط وقد ثبت أن تكون مفيدة لتحديد ميرناس التي تعتبر مهمة في تنظيم مجموعة متنوعة من العمليات، بما في ذلك الاستجابة المناعية، وتمايز الخلية، والعمليات الإنمائية، والمبرمج2. في الآونة الأخيرة، قد تم الاعتراف ميرناس لاحتمال استخدامها في تشخيص الأمراض والمداواة. للباحثين الذين يدرسون آليات لتنظيم الجينات وقياس التعبير ميرنا يمكن أن ينير نماذج النظم مستوى العمليات التنظيمية، لا سيما عندما يتم دمج المعلومات ميرنا مع التنميط مرناً وغيرها بيانات الجينوم-مقياس3. من ناحية أخرى، أظهرت أيضا أن تكون أكثر استقرارا من مرناس في مجموعة من أنواع العينات ميرناس وهي أيضا قابلة للقياس بقدر أكبر من الحساسية من بروتينات4. وادي ذلك إلى اهتمام كبير بتطوير ميرناس كالمؤشرات الحيوية للتطبيقات التشخيصية الجزيئية المختلفة، بما في ذلك أمراض الرئة.
في الرئة، ميرناس دوراً هاما في عملية التنمية والحفاظ على التوازن. وعلاوة على ذلك، قد تم التعبير عنها غير طبيعي المرتبطة بالتنمية والتقدم لمختلف الأمراض الرئوية5. مرض التهاب الرئة الناجمة عن تلوث الهواء قد أثبتت خطورة أكبر والتشخيص الأكثر فقراً في الإناث، مما يشير إلى أن تنظم الهرمونات والدورة الشبقية الرئة الفطرية التعبير الحصانة وميرنا في الاستجابة للتحديات البيئية 6-في هذا البروتوكول، نستخدم التعرض للأوزون، وهو عنصر رئيسي لتلوث الهواء، للحث على شكل من أشكال التهاب الرئة في الفئران الإناث التي تحدث في غياب مناعة التكيفية. باستخدام الأوزون، هي أننا حفز تنمية هايبرريسبونسيفينيس مجرى الهواء الذي يقترن بتلف الخلايا الظهارية مجرى الهواء وزيادة العَدلات ووسطاء التهابات في الخطوط الجوية الدانية7. حاليا، لا توجد بروتوكولات وصف جيد لوصف وتحليل ميرناس عبر دورة الشبقية في الفئران المعرضة للأوزون.
أدناه، ونحن تصف طريقة بسيطة لتحديد مراحل دورة الشبقية والتعبير ميرنا في أنسجة الرئة للفئران الإناث المعرضة للأوزون. علينا أيضا أن تعالج النهج الفعالة المعلوماتية الحيوية لتحديد الهدف واكتشاف ميرنا، مع تركيز على علم الأحياء الحسابي. نحن نحلل البيانات ميكرواري باستخدام ليما، برنامج R/بيوكوندوكتور التي توفر حلاً متكاملا لتحليل البيانات المستمدة من تجارب التعبير الجيني8. تحليل PCR صفيف بيانات من ليما له ميزة من حيث القدرة على اختبار t على أساس الإجراءات عند استخدام عدد صغير من الصفائف/عينات لمقارنة التعبير. لفهم سياق ميرنا التعبير النتائج البيولوجية، ثم استخدام برمجيات التحليل الوظيفي. من أجل فهم الآليات التي تنظم التغييرات النسخي والتنبؤ بالنتائج المحتملة، يجمع البرنامج ميرنا-التعبير مجموعات البيانات والمعارف من الأدب9. هذه هي ميزة مقارنة مع البرامج التي تبحث فقط عن تخصيب الإحصائية في تداخل لمجموعات من ميرناس.
Protocol
Representative Results
Discussion
MicroRNA التنميط أسلوب مفيد لتشخيص الأمراض والأبحاث الميكانيكية. في هذه المخطوطة، حددنا بروتوكولا لتقييم التعبير عن ميرناس الذي يتوقع أن تنظم جينات التهاب في الرئتين من الإناث الفئران المعرضة للأوزون في مراحل مختلفة من دورة الشبقية. أساليب لتحديد دورة الشبقية، مثل طريقة الكشف البصري، قد وص?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا البحث المنح المقدمة من المعاهد الوطنية للصحة K01HL133520 (PS) و K12HD055882 (PS). يشكر المؤلفون الدكتور جوانا فلورس للمساعدة مع تجارب التعرض للأوزون.
Materials
| C57BL/6J mice | The Jackson Laboratory | 000664 | 8 weeks old |
| UltraPure Water | Thermo Fisher Scientific | 10813012 | |
| Sterile plastic pipette | Fisher Scientific | 13-711-25 | Capacity: 1.7mL |
| Frosted Microscope Slides | Thermo Fisher Scientific | 2951TS | |
| Light microscope | Microscope World | MW3-H5 | 10X and 20X objective |
| Ketathesia- Ketamine HCl Injection USP | Henry Schein Animal Health | 55853 | 90 mg/kg. Controlled drug. |
| Xylazine Sterile Solution | Lloyd Laboratories | 139-236 | 10mg/kg. Controlled Drug. |
| Ethanol | Fisher Scientific | BP2818100 | Dilute to 70% ethanol with water. |
| 21G gauge needle | BD Biosciences | 305165 | |
| Syringe | Fisher Scientific | 329654 | 1mL |
| Operating Scissors | World Precision Instruments | 501221, 504613 | 14cm, Sharp/Blunt, Curved and 9 cm, Straight, Fine Sharp Tip |
| Tweezer Kit | World Precision Instruments | 504616 | |
| -80 ˚C freezer | Forma | 7240 | |
| Spectrum Bessman Tissue Pulverizers | Fisher Scientific | 08-418-1 | Capacity: 10 to 50mg |
| RNase-free Microfuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12400 | 1.5 mL |
| TRIzol Reagent | Thermo Fisher Scientific | 15596026 | |
| Direct-zol RNA MiniPrep Plus | Zymo Research | R2071 | |
| NanoDrop | Thermo Fisher Scientific | ND-ONE-W | |
| miScript II RT kit | Qiagen | 218161 | |
| Mouse Inflammatory Response & Autoimmunity miRNA PCR Array | Qiagen | MIMM-105Z | |
| Thin-walled, DNase-free, RNase-free PCR tubes | Thermo Fisher Scientific | AM12225 | for 20 μl reactions |
| miRNeasy Serum/Plasma Spike-in Control | Qiagen | 219610 | |
| Microsoft Excel | Microsoft Corporation | https://office.microsoft.com/excel/ | |
| Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | https://www.qiagenbioinformatics.com/products/ingenuity-pathway-analysis/ | |
| R Software | The R Foundation | https://www.r-project.org/ | |
| Thermal cycler or chilling/heating block | General Lab Supplier | ||
| Microcentrifuge | General Lab Supplier | ||
| Real-time PCR cycler | General Lab Supplier | ||
| Multichannel pipettor | General Lab Supplier | ||
| RNA wash buffer | Zymo Research | R1003-3-48 | 48 mL |
| DNA digestion buffer | Zymo Research | E1010-1-4 | 4 mL |
| RNA pre-wash buffer | Zymo Research | R1020-2-25 | 25 mL |
| Ultraviolet ozone analyzer | Teledyne API | Model T400 | http://www.teledyne-api.com/products/oxygen-compound-instruments/t400 |
| Mass flow controllers | Sierra Instruments Inc | Flobox 951/954 | http://www.sierrainstruments.com/products/954p.html |
参考文献
- Rebane, A., Akdis, C. A. MicroRNAs: Essential players in the regulation of inflammation. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 132 (1), 15-26 (2013).
- Cannell, I. G., Kong, Y. W., Bushell, M. How do microRNAs regulate gene expression?. Biochemical Society Transactions. 36 (Pt 6), 1224-1231 (2008).
- Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nature Reviews Genetics. 13 (5), 358-369 (2012).
- Mi, S., Zhang, J., Zhang, W., Huang, R. S. Circulating microRNAs as biomarkers for inflammatory diseases. Microrna. 2 (1), 63-71 (2013).
- Sessa, R., Hata, A. Role of microRNAs in lung development and pulmonary diseases. Pulmonary Circulation. 3 (2), 315-328 (2013).
- Fuentes, N., Roy, A., Mishra, V., Cabello, N., Silveyra, P. Sex-specific microRNA expression networks in an acute mouse model of ozone-induced lung inflammation. Biology of Sex Differences. 9 (1), 18 (2018).
- Aris, R. M., et al. Ozone-induced airway inflammation in human subjects as determined by airway lavage and biopsy. American Review of Respiratory Disease. 148 (5), 1363-1372 (1993).
- Ritchie, M. E., et al. limma powers differential expression analyses for RNA-sequencing and microarray studies. Nucleic Acids Research. 43 (7), e47 (2015).
- Krämer, A., Green, J., Pollard, J., Tugendreich, S. Causal analysis approaches in Ingenuity Pathway Analysis. バイオインフォマティクス. 30 (4), 523-530 (2014).
- Machholz, E., Mulder, G., Ruiz, C., Corning, B. F., Pritchett-Corning, K. R. Manual restraint and common compound administration routes in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (67), (2012).
- Umstead, T. M., Phelps, D. S., Wang, G., Floros, J., Tarkington, B. K. In vitro exposure of proteins to ozone. Toxicology Mechanisms and Methods. 12 (1), 1-16 (2002).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Phipson, B., Lee, S., Majewski, I. J., Alexander, W. S., Smyth, G. K. Robust hyperparameter estimation protects against hypervariable genes and improves power to detect differential expression. Annals of Applied Statistics. 10 (2), 946-963 (2016).
- Smyth, G. K., et al. Linear Models for Microarray and RNA-Seq Data User’s Guide. Bioconductor. , (2002).
- Benjamini, Y., Hochberg, Y. Controlling the False Discovery Rate: A Practical and Powerful Approach to Multiple Testing. Journal of the Royal Statistical Society. Series B (Methodological). 57 (1), 289-300 (1995).
- Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. Mouse estrous cycle identification tool and images. Public Library of Science ONE. 7 (4), e35538 (2012).
- Alves, M. G., et al. Comparison of RNA Extraction Methods for Molecular Analysis of Oral Cytology. Acta Stomatologica Croatica. 50 (2), 108-115 (2016).
- Wilfinger, W. W., Mackey, K., Chomczynski, P. Effect of pH and ionic strength on the spectrophotometric assessment of nucleic acid purity. Biotechniques. 22 (3), 478-481 (1997).
- Bustin, S. A., et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clinical Chemistry. 55 (4), 611-622 (2009).
- Walker, S. E., Lorsch, J. RNA purification- precipitation methods. Methods in Enzymology. 530, 337-343 (2013).
- Git, A., et al. Systematic comparison of microarray profiling, real-time PCR, and next-generation sequencing technologies for measuring differential microRNA expression. RNA. 16 (5), 991-1006 (2010).
- Smyth, G. K. Limma: linear models for microarray data. Bioinformatics and Computational Biology Solutions Using R and Bioconductor. , 397-420 (2005).
- Griffiths-Jones, S. miRBase: the microRNA sequence database. Methods Mol Biol. 342, 129-138 (2006).
- Sethupathy, P., Corda, B., Hatzigeorgiou, A. TarBase: A comprehensive database of experimentally supported animal microRNA targets. RNA. 12 (2), 192-197 (2006).
- Agarwal, V., Bell, G. W., Nam, J., Bartel, D. P. Predicting effective microRNA target sites in mammalian mRNAs. eLife. 4, e05005 (2015).
- Xiao, F., Zuo, Z., Cai, G., Kang, S., Gao, X., Li, T. miRecords: an integrated resource for microRNA-target interactions. Nucleic Acids Res. 37, D105-D110 (2009).
- Mullany, L. E., Wolff, R. K., Slattery, M. L. Effectiveness and Usability of Bioinformatics Tools to Analyze Pathways Associated with miRNA Expression. Cancer Informatics. 14, 121-130 (2015).
