概要
O locus coeruleus é um pequeno aglomerado de neurônios envolvidos em uma variedade de processos fisiológicos. Aqui, descrevemos um protocolo para preparar seções de cérebro de rato para estudos de proteínas e metais neste núcleo.
Abstract
O locus coeruleus (LC) é um importante polo de noradrenalina produzindo neurônios que modulam a um número de funções fisiológicas. Anormalidades estruturais ou funcionais do LC impacto de várias regiões do cérebro, incluindo o córtex, hipocampo e cerebelo e podem contribuir para a depressão, transtorno bipolar, ansiedade, bem como doença de Parkinson e doença de Alzheimer. Estes distúrbios são frequentemente associados com misbalance de metal, mas o papel dos metais na LC é apenas parcialmente compreendido. Estudos morfológicos e funcionais da LC são necessários para melhor compreender as patologias humanas e contribuição de metais. Os ratos são um modelo experimental utilizado, mas o mouse LC é pequeno (~0.3 mm de diâmetro) e difícil de identificar para um não-especialista. Aqui, descrevemos um protocolo baseado em imuno-histoquímica passo a passo para localizar o LC no cérebro do rato. Dopamina-β-hidroxilase (DAP) e, alternativamente, Tirosina Hidroxilase (TH), duas enzimas altamente expressadas na LC, são utilizados como marcadores imuno-histoquímicos em fatias de cérebro. Seções adjacentes às seções contendo LC podem ser usadas para uma análise mais adicional, incluindo histologia para estudos morfológicos, testes metabólicos, bem como imagens de metal por microscopia de fluorescência de raios-x (XFM).
Introduction
O locus coeruleus (LC) é uma região importante do tronco cerebral e um importante local de produção de norepinefrina (NE)1. A LC envia projeções em todo o cérebro2 para o córtex, do hipocampo e do cerebelo3 e regula os principais processos fisiológicos, incluindo o ritmo circadiano4,5, atenção e memória6, estresse emoção9,10, processos cognitivos8e7. Disfunção de LC tem sido implicada em distúrbios neurológicos e neuropsiquiátricos11, incluindo Parkinson doença12,13,14, doença de Alzheimer14, depressão15 ,16,17, transtorno bipolar,18,19e ansiedade20,21,22,23, 24. tendo em conta estes papéis, análise da LC é crucial para estudar sua função e disfunção.
Os ratos são amplamente utilizados para estudos de processos de alterações fisiológicos e fisiopatológicas. Devido ao seu pequeno tamanho, o mouse LC tem um diâmetro médio de ~ 300 μm, levando a dificuldade de localizar a estrutura. Durante o corte de cérebro, LC pode ser facilmente perdida nas secções coronais ou sagitais. Estudos disponíveis, descrevendo a identificação de LC em animais não oferecem um protocolo passo a passo que um não-especialista pode acompanhar1,25. Assim, para oferecer orientação para localização de LC, descrevemos um protocolo que desenvolvemos para localizar esta região do cérebro de rato para várias aplicações (Figura 1, Figura 2, Figura 3). O protocolo aplica-se cuidadosamente controladas cérebro seccionamento e imuno-histoquímica de deteção de DAP26,27, ou, alternativamente, TH24, ambas enzimas altamente enriquecidas em LC28. Uma vez que a LC está localizado por imuno-histoquímica, fatias de cérebro adjacente podem ser usadas para estudos adicionais, incluindo análises morfológicas e metabólicas, bem como estudos de imagiologia metais através de de microscopia (XFM) de fluorescência de raios-x29. Descrevemos XFM como exemplo neste protocolo (Figura 3).
Protocol
Representative Results
Discussion
Orientar corretamente o espécime é um passo crucial no presente protocolo. Porque nós estamos usando características anatômicas da superfície dorsal do cérebro para localizar LC (fronteira entre o cerebelo e colículo inferior), é importante que as seções ser alinhados corretamente. Isto requer cuidado em definir corretamente o cérebro na matriz de fatiador de cérebro de rato. Recomendamos cortar ~ 500 μm mais tecido anterior e posterior à LC para evitar perder o núcleo. O erro mais comum é cortar seçõe…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Abigael Muchenditsi para a manutenção da colônia do mouse. Uso da fonte de fótons avançada no Argonne National Laboratory foi apoiado pelo departamento de energia dos EUA, escritório de ciência, escritório de base energia Ciências, sob o número do contrato: DE-AC02-06CH11357. Agradecemos a Olga Antipova e Dr. Stefan Vogt para assistência na fonte de fótons avançada e suporte ao usuário. Este trabalho foi financiado pelo 2R01GM101502 de concessão Instituto Nacional de saúde para SL.
Materials
| Adult mouse brain slicer matrix | Zivic Instruments | BSMAS001-1 | |
| Anti-rabbit secondary antibody, Alexa Fluor 488 (source – donkey) | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
| Charged glass slides | Genesee | 29-107 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 | |
| Cryostat | Microm GmbH | HM 505E | |
| Cryostat cutting blades | Thermo Fisher Scientific | MX35 | |
| Scissors Mini, 9.5cm | Antech Diagnostcs | 503241 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole) | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – inhouse production (source – rabbit) | B. Eipper | – | |
| Dopamine β-hydroxylase (DBH) antibody – commercially availabe (source – rabbit) | Cell Signaling | 8586 | |
| Falcon tubes, 50ml | USA Scientific | 339652 | |
| Forane (isofluorane) | Baxter | NDC 1019-360-60 | |
| Forceps Micro Adson | Antech Diagnostcs | 501245 | |
| Hardset mounting media | EM sciences | 17984-24 | |
| Microscope | Pascal | LSM 5 | |
| Multi-well plates, 24 wells | Thermo Fisher Scientific | 930186 | |
| Optimal cutting temperature compound (OCT) | VWR/ tissue tech | 102094-106 | |
| Paraformaldehyde (PFA)/ formalin 10% | Fisher Scientific | SF98-4 | |
| Peel-A-Way disposable embedding molds | Polysciences Inc. | 18646A | |
| Pencil brush | |||
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Tech | 14190250 | |
| Razor blades | Amazon | ASIN: B000CMFJZ2 | |
| Spatulas | Antech Diagnostcs | 14374 | |
| T pins | Office Depot | 344615 | |
| The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates, Paxinos and Franklin, 3rd Edition | Amazon | ISBN: 978-0123694607 | |
| Triton-X 100 (to prepare PBSD) | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-500ml | |
| Tyrosine hydroxylase (TH) antibody (source – rabbit) | EMD Millipore | AB152 | |
| Ultralene thin film for XRF | SPEX Sample Prep | 3525 | |
| Wide-field fluorescent microscope | Zeiss | Axio Zoom.V16 | |
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