Изоляция тканей внеклеточных пузырьков от печени

Все исследования с участием животных были проведены в соответствии с протоколом, который был одобрен клиникой Майо институционального ухода за животными и использования комитета. 1. Подготовка скамейки Приготовьте водяную баню и установите ее до 37 градусов по Цельсию. Другое необходимое оборудование и настройка показаны на рисунке 1. Измерьте 100 мг коллагеназа типа IV и добавьте его в колбу 125 мл, содержащую 100 мл HBSS в водяной бане (40 градусов по Цельсию). Убедитесь, что коллагеназа была растворена путем закрученного жидкости в колбе, а также убедитесь, что колба полностью погружена в водяную ванну. Для большей эффективности, позвольте коллагенезе раствориться, по крайней мере 30 мин, даже если он может показаться, растворяются мгновенно. Погрузите колбу 125 мл, содержащую 50 мл HBSS, в водяной бане при 40 градусах Цельсия. Это будет использоваться для первоначального промывки. Спрей вниз по поверхности всех инструментов, таких как ножницы и щипцы с 70% этанола. Подготовьте несколько чистых ватных тампонов. Промыть трубки насоса, запустив 70% этанола через насос и удалить любой остаточный этанол путем промывки его дважды с проточной водой. Положите абсорбирующим скамейке площадку на скамейке лаборатории и место жесткий контейнер коробки на вершине. Это будет необходимо, чтобы содержать любые избыточные жидкости во время перфузии мыши. Оберните полистирол пены площадку с алюминиевой фольгой и поместите его в контейнер. Поместите стерильное блюдо культуры 10 см рядом со скамейкой. Это будет использоваться для хранения переваренной печени после перфузии завершена. Налейте 10 мл коллагенеза среды (шаг 1.2) в стерильной культуры блюдо заранее. Используя крылатый набор сбора крови, подключите 23-калибровочный к свободному концу трубки насоса (отрезав крылья от канюли бабочки может привести к лучшей управляемости). Пройдите до тех пор, пока кончик канюли сбора крови не будет заполнен. 2. Подготовка животных Перед началом анестезии с использованием изофруран, убедитесь, что достаточное количество газа питания доступна в течение всего срока процедуры. Включите кислород (O2) поставки в индукционную камеру на 1-2 л, затем включите изофларан между 2-4% с помощью потока. Положите мышь в индукционную камеру и закройте верхнюю дверь. Мониторинг мыши, пока он не лежа.ПРИМЕЧАНИЕ: Газы в камере будут держать мышей под анестетом в течение нескольких минут. Поместите мышь на полистирол пены площадку, завернутые в алюминиевую фольгу. Переключите поток из индукционной камеры в носекон. Убедитесь, что анестезия является адекватной. Если мышь начала реагировать, осторожно сдержать его в конусе носа, пока он полностью анестезируется. Обеспечить анестезию путем мониторинга дыхания и реагирования на стимуляцию во время процедуры. Отрегулируйте скорость потока по мере необходимости, чтобы обеспечить адекватную анестезию. Лапы должны быть не реагируют на щепотку тест под наркозом. Дополнительную информацию можно получить из лабораторного руководства по уходу за животными. Лента или прикрепите все четыре конечности мыши. Очистите кожу над животом, распыляя 70% этанола и вытирая его марлей и спиртовой площадкой. Этот шаг имеет решающее значение, чтобы избежать загрязнения от мыши меха. Сделайте широко открытый прорези через кожу от передней до таза кости с помощью набора стерильных ножниц. Будьте осторожны, чтобы не сократить любые внутренние органы . Вытесните кишечник на левую сторону животного с помощью хлопка наконечником аппликатор мягко подвергать портал вены (PV) и нижней полы вены (IVC). 3. Каннулуляция и перфузия (0,5 ч) Используя изогнутые щипцвые, поместите нить под вену портала и связать узел свободно, чтобы подготовить cinching плотно после канистики. Вставьте канюлю (23G из набора для сбора крови) в вену портала на 5-10 мм ниже лигатуры. Не вставляйте канюль мимо первой ветви портала, иначе правая передняя доли может быть недостаточно проникнута. Канюля может быть исправлена или закреплена нитью с помощью пробки узел. Запустите насос для настояться в HBSS при низкой скорости потока (1-2 мл/мин). Как только канналяция будет подтверждена успешной, печень начнет бланшировать. Вырезать IVC, чтобы облегчить давление и позволить чрезмерной жидкости в печени, чтобы стечь. Это лучше всего выполнять с помощью операторов с другой стороны, чтобы канюля не перемещается. Медленно увеличивайте скорость потока до 8 мл/мин и завершите перфузию, используя весь объем HBSS мощностью 50 мл через печень, в течение следующих 5 мин. Измените коллагенеза, содержащая среднюю (шаг 1.2) в стакан непосредственно перед HBSS начинает иссякать. Убедитесь, что пузырьки воздуха не присутствуют и не текут в печень при изменении среды. Нанесите преходящее давление на IVC с интервалом 5 с путем зажима щипками. Это приведет к печени набухают и поможет с пищеварением тканей и диссоциации (7-8 мин). Как пищеварение прогрессирует, печень будет набухать и стать белым. Печень может набухать равномерно примерно в два раза его первоначальный размер. Выключите насос и удалите канюли, как только пищеварение будет завершено. Завершение пищеварения печени будет зависеть от размера мыши и состояния печени. Вмятина в печени можно наблюдать, если хлопчатобумажный аппликатор используется для мягко зондирования печени. Удалить желчный пузырь из печени, стараясь не рвать его. Используя вымытую ножницу и щипцы, извлеките печень из мыши в стерильное 10-сантиметровое культурное блюдо, содержащее фосфатно-буферный солей (PBS) для поверхностного мытья. Перенесите печень тщательно в стерильное 10 см культуры блюдо, содержащее коллагенеза среды (от шага 1.8). Это критический шаг для избежания загрязнения от крови мыши и желчи. Захватите и разорвать печень с двумя чистыми щипками в то время как осторожно встряхивая клетки из печени. По мере того как это случается, средство будет быть затуманено. Все гепатоциты можно встряхнуть, оставив за собой соединительную ткань и сосудистую ткань. Triturate клеточного раствора много раз с помощью 3 мл шприца до тех пор, пока непереваренные части печени стряхивают. Налейте его в 50 мл конической трубки с 70 мкм нейлоновых клеток ситечко для фильтрации любой непереваренной соединительной ткани. Вымойте блюдо с HBSS, чтобы собрать оставшиеся клетки и заполнить 50 мл конической трубки. Centrifuge мягко 50 мл конической трубки в размахивая ротор ведро на 50 х г в течение 10 минут при 4 c. Перенесите супернатант на новую коническую трубку 50 мл. 4. Изоляция ЭВ (5 ч) Центрифуга супернатант на 300 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Перенесите супернатант в новую коническую трубку мощностью 50 мл. Центрифуга супернатант на 2000 х г в течение 20 мин при 4 кв КС, чтобы удалить мусор и агрегаты клеток. Перенесите супернатант в трубку с круглым дном и центрифугия супернатант на 10000 х г в течение 70 минут при 4 “C. Соберите супернатант и поместите в поликарбонатную ультрацентрифугу и центрифугу при 100 000 х г в течение 70 мин при 4 градусах Цельсия. Соберите гранулы в ультрацентрифуге трубки, которая затем промывают повторноприостановления в PBS. Centrifuge супернатант далее на 100000 х г в течение 70 мин при 4 КС. Окончательные гранулы, состоящие из клеточных нановезиклов, могут быть непосредственно использованы для экспериментов или повторно приостановлены с 1000 Л Л ПБС и храниться при -80 градусах Цельсия. 5. Оценка качества и урожайности изоляций Оцените распределение и концентрацию размера с помощью анализа отслеживания наночастиц или настраиваемого резистивного зондирования импульса в соответствии с протоколами производителя приборов. Выполняйте дальнейшую изоляцию и очистку конкретных популяций везикул с помощью различных подходов, таких как добавление градиента сахарозы или подушки, методы иммуноаффинити или хроматография исключения размера, основанная на конкретных экспериментальных потребностях.