간에서 조직 세포 외 소포의 격리

동물과 관련된 모든 연구는 메이요 클리닉 기관 동물 관리 및 사용 위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행되었다. 1. 벤치 준비 수조를 준비하고 37 °C로 설정합니다. 기타 필요한 장비 및 설정은 그림1에 나와 있습니다. 콜라게나아제 타입 IV 100 mg을 측정하고 수조(40°C)에서 HBSS 100 mL를 함유하는 125 mL 플라스크에 첨가합니다. 콜라게나아제는 플라스크의 액체를 소용돌이치면서 용해되었는지 확인하고 플라스크가 수조에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오. 효율성을 높이기 위해 콜라게나아제는 즉시 용해되는 것처럼 보일지라도 적어도 30분 동안 용해되도록 하십시오. 40°C의 수조에 50 mL의 HBSS를 함유한 125 mL 플라스크를 담급니다. 이것은 초기 플러싱에 사용됩니다. 가위와 집게와 같은 모든 기기의 표면에 70% 에탄올을 뿌린다. 깨끗한 면봉몇 개 준비합니다. 펌프를 통해 70 % 에탄올을 실행하여 펌프의 튜브를 헹구고 흐르는 물로 두 번 헹구어 잔류 에탄올을 제거하십시오. 흡수성 벤치 패드를 실험실 벤치에 놓고 하드 박스 용기를 위에 놓습니다. 이것은 마우스 관류 도중 어떤 과잉 액체든지 포함하는 것을 필요로 할 것입니다. 알루미늄 호일로 폴리스티렌 폼 패드를 감싸고 용기 안에 넣습니다. 멸균 10cm 배양 접시를 벤치 가까이에 놓습니다. 이것은 관류가 완료된 후에 소화된 간을 붙들기 위하여 이용될 것입니다. 콜라게나아제 배지 10 mL(1.2단계)를 멸균 배양 접시에 미리 붓습니다. 날개 달린 혈액 수집 세트를 사용하여 23 게이지를 펌프 튜브의 자유 끝에 연결하십시오 (나비 캐뉼라에서 날개를 자르면 더 나은 핸들링으로 이어질 수 있습니다). 혈액 채취의 캐뉼라 끝이 채워지때까지 통과합니다. 2. 동물 준비 isoflurane를 사용하여 마취를 시작하기 전에 절차 기간 동안 적절한 양의 공급 가스를 사용할 수 있는지 확인하십시오. 산소 (O2)공급을 1-2 L에서 유도 챔버에 켜고 유량계를 사용하여 2-4 % 사이의 이소플루란을 켭니다. 유도 챔버에 마우스를 넣고 상단 문을 닫습니다. 마우스가 다시 작동될 때까지 모니터링합니다.참고 : 챔버의 가스는 몇 분 동안 마우스를 마취 유지합니다. 알루미늄 호일로 감싼 폴리스티렌 폼 패드에 마우스를 놓습니다. 유도 챔버에서 노코콘으로 흐름을 전환합니다. 마취가 적절한지 확인하십시오. 마우스가 반응하기 시작하면 완전히 마취될 때까지 코 콘에 부드럽게 억제하십시오. 시술 중 호흡과 자극에 대한 반응을 모니터링하여 마취를 보장합니다. 적절한 마취를 보장하기 위해 필요에 따라 속도 유량계를 조정합니다. 발은 마취하에 핀치 테스트에 반응하지 않아야합니다. 동물 관리를 위한 추가 상세 정보는 실험실 가이드로부터 얻을 수 있다. 마우스의 네 개의 팔다리를 테이프로 붙이거나 고정합니다. 70% 에탄올을 분사하고 거즈와 알코올 패드로 닦아내면 복부 에디멘의 피부를 깨끗하게 합니다. 이 단계는 마우스 퍼의 오염을 방지하는 데 중요합니다. 멸균 가위 세트를 사용하여 앞쪽에서 골반 뼈까지 피부를 넓게 잘라냅니다. 내부 장기를 자르지 않도록주의하십시오. 면 팁 어플리케이터를 사용하여 동물의 왼쪽으로 장의 변위를 하여 문맥(PV)과 열등한 정맥(IVC)을 부드럽게 노출시십시오. 3. 통조림 및 관류 (0.5 시간) 구부러진 집게를 사용하여 문 정맥 아래에 스레드를 놓고 매듭을 느슨하게 묶어 통조림 후 단단히 조여냅니다. 캐뉼라 (혈액 채취 세트에서 23G)를 합자 아래 5-10mm의 문맥에 삽입하십시오. 그렇지 않으면 오른쪽 전방 엽이 부적절하게 perfused 될 수 있습니다, 첫 번째 포털 분기 를 지나 캐뉼라를 삽입하지 마십시오. 캐뉼라는 스토퍼 매듭을 사용하여 스레드로 고정하거나 고정 할 수 있습니다. 펌프를 시작하여 낮은 유량(1-2mL/min)으로 HBSS에 주입합니다. 통조림이 성공으로 확인되면 간이 희미해지기 시작합니다. 압력을 완화 하 고 배수 간 내 과도 한 액체를 허용 하기 위해 IVC를 잘라. 캐뉼라가 이동되지 않도록 다른 손으로 연산자를 사용하여 수행하는 것이 가장 좋습니다. 천천히 8 mL /min로 유량을 증가시키고 다음 5 분 동안 간을 통해 HBSS의 전체 50 mL 부피를 사용하여 관류를 완료하십시오. HBSS가 다 소진되기 직전에 배지(1.2단계)를 함유한 콜라게나아제들을 비커로 바꾼다. 기포가 존재하지 않고 매체를 변경할 때 간으로 흘러 들어가지 않도록 하십시오. 집게로 클램핑하여 5s 간격으로 IVC에 과도 압력을 가합니다. 이것은 간이 팽창하고 조직 소화 및 해리를 돕습니다 (7-8 분). 소화가 진행됨에 따라 간은 부풀어 오며 하얗게 됩니다. 간은 원래 크기의 약 두 배로 균일하게 팽창 할 수 있습니다. 소화가 완료되면 펌프를 끄고 캐뉼라를 제거합니다. 간 소화의 완료는 마우스의 크기와 간 상태에 따라 달라집니다. 면 팁 어플리케이터를 사용하여 간을 부드럽게 탐사하면 간에서 움푹 들어간 곳을 관찰 할 수 있습니다. 간에서 담낭을 제거, 그것을 찢어하지 않도록주의. 세척된 가위와 집게를 사용하여 마우스에서 간을 표면 세척을 위해 인산완충식염수(PBS)를 함유한 멸균 된 10cm 배양 접시로 추출합니다. 콜라게나아제 배지가 함유된 멸균 10cm 배양 접시에 간을 조심스럽게 옮김(1.8단계부터). 이것은 마우스 혈액과 담즙에서 오염을 피하기위한 중요한 단계입니다. 간에서 세포를 부드럽게 흔들면서 두 개의 깨끗한 집게로 간을 잡고 찢어버십시오. 이 경우 미디어는 흐려집니다. 모든 간세포는 결합 조직과 혈관 조직을 남기고 멀리 흔들 릴 수 있습니다. 간장의 소화되지 않은 부분이 흔들릴 때까지 3 mL 주사기를 사용하여 세포 용액을 여러 번 삼중화하십시오. 70 μm 나일론 세포 스트레이너가있는 50 mL 원엽 튜브에 부어 소화되지 않은 결합 조직을 필터링하십시오. 나머지 세포를 수집하고 50mL 원엽 튜브를 채우기 위해 HBSS로 접시를 씻으십시오. 원심분리기는 50 x g에서 스윙 버킷 로터에서 50 mL 원엽 튜브를 4°C에서 10분 동안 부드럽게 한다. 상급체를 새로운 50 mL 원유관으로 옮김. 4. 전기 자동차 분리 (5 시간) 4°C에서 10분 동안 300 x g에서 상원지를 한다. 상급체를 새로운 50 mL 원유관으로 옮김. 4°C에서 20분 동안 2000 x g에서 상원지를 제거하여 세포 파편 및 응집체를 제거하였다. 상급체를 둥근 바닥 튜브로 옮기고 4°C에서 70분 동안 10,000 x g의 상급원지를 원심분리합니다. 상급체를 수집하고 4 °C에서 70 분 동안 100,000 x g에서 폴리 카보네이트 초원심분리기 튜브 및 원심 분리기에 놓습니다. 다음 PBS에서 다시 일시 중단하여 세척되는 초원심분리튜브에 펠릿을 수집합니다. 4°C에서 70분 동안 100,000 x g에서 상원지를 더 심분리한다. 세포 나노베시클으로 구성된 최종 펠릿은 1000 μL의 PBS로 실험또는 재부유및 -80°C에서 저장되는 실험에 직접 사용될 수 있다. 5. 격리의 품질 및 수율 평가 기기 제조업체의 프로토콜에 따라 나노입자 추적 분석 또는 조정 가능한 저항 펄스 감지를 사용하여 크기 분포 및 농도를 평가합니다. 특정 실험 적 필요에 기초하여 자당 그라데이션 또는 쿠션, 면역 affinity 기술 또는 크기 배제 크로마토그래피의 첨가와 같은 다양한 접근법에 의해 특정 소포 집단의 추가 절연 및 정제를 수행한다.