JoVE Journal > Biochemistry
概要
Abstract
Introduction
Protocol
結果
Discussion
開示
Acknowledgements
Materials
参考文献
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
生化学

Isolierung von Gewebe extrazellulären Vesikeln aus der Leber

Published: August 21, 2019
doi:
10.3791/58649
, ,
1Department of Transplantation,Mayo Clinic

概要

Dies ist ein Protokoll, um Gewebe extrazelluläre Vesikel (EVs) aus der Leber zu isolieren. Das Protokoll beschreibt einen zweistufigen Prozess mit Kollagenaseperfusion, gefolgt von differentialer Ultrazentrifugation, um Lebergewebe-EVs zu isolieren.

Abstract

Extrazelluläre Vesikel (EVs) können aus vielen verschiedenen Zelltypen freigesetzt und in den meisten, wenn nicht allen Körperflüssigkeiten nachgewiesen werden. Elektrofahrzeuge können an der Zell-zu-Zell-Kommunikation teilnehmen, indem sie bioaktive Moleküle wie RNA oder Protein von einer Zelle zur anderen schließen. Die meisten Studien über Elektrofahrzeuge wurden in Zellkulturmodellen oder in EVs durchgeführt, die von Körperflüssigkeiten isoliert sind. Es zeichnet sich ein Interesse an der Isolierung von Elektrofahrzeugen aus Geweben ab, um ihren Beitrag zu physiologischen Prozessen zu untersuchen und wie sie bei Krankheiten verändert werden. Die Isolierung von Elektrofahrzeugen mit ausreichender Ausbeute aus Geweben ist technisch eine Herausforderung, da eine Gewebedissoziation ohne Zellschäden erforderlich ist. Diese Methode beschreibt ein Verfahren zur Isolierung von Elektrofahrzeugen aus Mauslebergewebe. Die Methode beinhaltet einen zweistufigen Prozess, beginnend mit der In-situ-Kollagenase-Verdauung, gefolgt von einer differenziellen Ultrazentrifugation. Die Gewebeperfusion mit Kollagennase bietet aufgrund der erhöhten Ausbeute an erhaltenen Elektrofahrzeugen einen Vorteil gegenüber dem mechanischen Schneiden oder homogenisieren des Lebergewebes. Die Verwendung dieses zweistufigen Prozesses, um Elektrofahrzeuge aus der Leber zu isolieren, wird für die Untersuchung von Gewebe-EVs nützlich sein.

Introduction

Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind membrangebundene Vesikel, die aus vielen verschiedenen Zelltypen im Körper freigesetzt werden. Elektrofahrzeuge enthalten eine Ladung von Molekülen, die RNA, DNA und Protein enthalten. Die Übertragung dieser Ladung durch Elektrofahrzeuge von einer Zelle in eine andere wird als ein Mechanismus postuliert, durch den Zellen innerhalb des Gewebes miteinander kommunizieren1. Die meisten Informationen über die Ladung oder die Rolle von Elektrofahrzeugen bei normaler Gesundheit und Krankheiten stammen aus Studien über Elektrofahrzeuge, die aus Zellen in Kultur gewonnen oder aus dem Kreislauf oder anderen Körperflüssigkeiten gesammelt wurden2. Um ihre physiologischen Rollen in vivozu verstehen, ist eine robuste Methode für die Isolierung von Gewebe-EVs notwendig, die alle Populationen von Elektrofahrzeugen erfasst und zelluläre Schäden oder Kontaminationen vermeidet3. Das übergeordnete Ziel der hier beschriebenen Methode ist es, Gewebe-EVs von Mauslebern zu isolieren.

Die meisten Zelltypen in der Leber haben gezeigt, dass EVs produzieren, und die Studie der EV-basierten Signalisierung fördert Grundwissen und Verständnis von Lebererkrankungen. Die kombinierte Wirkung von Elektrofahrzeugen aus verschiedenen Zelltypen innerhalb von Geweben wird jedoch nur teilweise verstanden. Die Isolierung von Elektrofahrzeugen aus Lebergewebe ist notwendig, um die In-situ-Beiträge von Elektrofahrzeugen innerhalb des Gewebemilieus zu verstehen. Der hier beschriebene Ansatz basiert auf einer zweistufigen Perfusion, um die Gewebedissoziation zu verbessern und Zellschäden zu minimieren. Anschließend werden Elektrofahrzeuge aus dem dissoziierten Lebergewebe isoliert. Ansätze, die eine zweistufige Perfusion zur Isolierung von Hepatozyten verwenden, werden seit den frühen 1950er Jahrenverwendet 4. Diese Methoden zur Hepatozytenisolation wurden modifiziert und kontinuierlich verbessert und sind nun Standardansätze für die Isolierung von Hepatozyten in Kulturen, in Zellsuspensionen und aus Geweben5,6,7. Im ersten Schritt wird die Leber einer nicht rezirkulierenden Perfusion mit kalziumfreiem Puffer, Hanks ausgewogener Salzlösung (HBSS), unterzogen. Im zweiten Schritt wird die Leber mit Kollagenase durchdrungen, um die extrazelluläre Matrix zur weiteren Trennung von desmosomalen Zell-zu-Zell-Verbindungen aufzulösen. Eine optimale Behandlungszeit für die Kollagenaseauflösung beträgt 7 bis 10 Minuten. Eine kürzere Behandlungsdauer führt zu unvollständiger Auflösung und Beibehaltung von Zellkontakten in der Leber, während eine längere Dauer Leberschäden oder Eine Unterbrechung der Portalvene verursachen kann. Elektrofahrzeuge werden dann mittels Differentialzentrifugation isoliert, um Zellen und zellulären Schutt zu entfernen. Daraus resultiert eine EV-Sammlung in hohen Erträgen, die für weitere nachgelagerte Analysen oder Studien verwendet werden können.

Protocol

Alle Studien mit Tieren wurden in Übereinstimmung mit einem Protokoll durchgeführt, das vom Mayo Clinic Institutional Animal Care and Use Committee genehmigt wurde. 1. Bankvorbereitung Bereiten Sie ein Wasserbad vor und stellen Sie es auf 37 °C ein. Die anderen erforderlichen Ausrüstungen und Einrichtungen sind in Abbildung 1dargestellt. Messen Sie 100 mg Kollagennase Typ IV und fügen Sie ihn einem 125 ml-Kolben mit 100 ml HBSS in einem Wasserbad (40 °C) hinzu. Stellen Sie sicher, dass die Kollagenase gelöst wurde, indem Sie die Flüssigkeit im Kolben wirbeln, und stellen Sie auch sicher, dass der Kolben vollständig in das Wasserbad getaucht wird. Für eine höhere Effizienz, lassen Sie die Kollagenase für mindestens 30 min auflösen, auch wenn es sofort zu lösen scheinen. Untertauchen Sie einen 125 ml Kolben mit 50 ml HBSS in einem Wasserbad bei 40 °C. Dies wird für die erstmalige Spülung verwendet. Sprühen Sie die Oberfläche aller Instrumente wie Schere und Zange mit 70% Ethanol. Bereiten Sie ein paar saubere Wattestäbchen vor. Spülen Sie die Schläuche der Pumpe aus, indem Sie 70% Ethanol durch die Pumpe laufen lassen, und entfernen Sie jegliches Restethanol, indem Sie es zweimal mit fließendem Wasser ausspülen. Legen Sie ein saugfähiges Bankpolster auf die Laborbank und legen Sie einen Hartkastenbehälter darüber. Dies wird benötigt, um überschüssige Flüssigkeiten während der Mausperfusion zu enthalten. Wickeln Sie ein Polystyrol-Schaumpad mit Aluminiumfolie und legen Sie es in den Behälter. Legen Sie eine sterile 10 cm Kulturschale in der Nähe der Bank. Dies wird verwendet, um die verdautleber Leber zu halten, nachdem die Perfusion abgeschlossen ist. 10 ml Kollagenasemedium (Schritt 1.2) im Voraus in ein steriles Kulturgericht gießen. Verbinden Sie mit einem geflügelten Blutentnahmeset die 23-Spur mit dem freien Ende des Pumpenschlauchs (das Abschneiden der Flügel von der Schmetterlingskanüle kann zu einer besseren Handhabung führen). Pass, bis die Spitze der Kanüle der Blutentnahme gefüllt ist. 2. Tierzubereitung Bevor Sie mit der Anästhesie mit Isofluran beginnen, stellen Sie sicher, dass für die Dauer des Verfahrens eine ausreichende Menge an Versorgungsgas zur Verfügung steht. Schalten Sie die Sauerstoffzufuhr (O2) der Induktionskammer bei 1-2 L ein, und schalten Sie isoflurane dann mit einem Durchflussmesser zwischen 2-4% ein. Setzen Sie die Maus in die Induktionskammer und schließen Sie die obere Tür. Überwachen Sie die Maus, bis sie zurückliegt.HINWEIS: Die Gase in der Kammer halten die Mäuse für mehrere Minuten beästhetisiert. Legen Sie die Maus auf ein Polystyrol-Schaumpad mit Aluminiumfolie umwickelt. Schalten Sie den Durchfluss von der Induktionskammer auf einen Nosecone um. Stellen Sie sicher, dass die Anästhesie ausreichend ist. Wenn die Maus reagiert hat, halten Sie sie vorsichtig in einem Nasenkegel zurück, bis die sie vollständig beästhebt ist. Sicherstellen der Anästhesie durch Überwachung der Atmung und Reaktion auf Stimulation während des Eingriffs. Passen Sie das Durchflussmesser nach Bedarf an, um eine ausreichende Anästhesie zu gewährleisten. Die Pfoten müssen nicht auf den Pinch-Test unter Anästhesie reagieren. Weitere Angaben sind dem Laborführer für die Pflege von Tieren zu entnehmen. Befestigen oder fixieren Sie alle vier Gliedmaßen der Maus. Reinigen Sie die Haut über dem Bauch, indem Sie mit 70% Ethanol besprühen und sie mit Gaze und einem Alkoholpad abwischen. Dieser Schritt ist entscheidend, um eine Kontamination durch das Mausfell zu vermeiden. Machen Sie einen weit offenen Schnitt durch die Haut vom vorderen bis zum Beckenknochen mit einer Reihe von sterilen Scheren. Achten Sie darauf, keine inneren Organe zu schneiden. Verdrängen Sie den Darm auf die linke Seite des Tieres, indem Sie einen baumwollefarbenen Applikator verwenden, um die Portalvene (PV) und die minderwertige Vena cava (IVC) sanft freizulegen. 3. Cannulation und Perfusion (0,5 h) Mit gekrümmten Zangen, legen Sie einen Faden unter die Portalvene und binden Sie einen Knoten lose, um Cinching fest nach der Cannulation vorzubereiten. Setzen Sie die Kanüle (23G aus dem Blutentnahmeset) in die Portalvene 5-10 mm unterhalb der Ligatur ein. Fügen Sie die Kanüle nicht hinter dem ersten Portalzweig ein, da sonst der rechte vordere Lappen unzureichend durchdren werden kann. Die Kanüle kann mit einem Stopperknoten fixiert oder mit Gewinde befestigt werden. Starten Sie die Pumpe, um in HBSS bei einer niedrigen Durchflussrate (1-2 ml/min) einzufließen. Sobald die Konservenulation bestätigt wird, um erfolgreich zu sein, wird die Leber beginnen zu blanchieren. Schneiden Sie die IVC, um Druck zu entlasten und lassen Sie übermäßige Flüssigkeit in der Leber abfließen. Dies wird am besten mit den Operatoren anderer Hand durchgeführt, so dass die Kanüle nicht verschoben wird. Erhöhen Sie den Durchfluss langsam auf 8 ml/min und vervollständigen Sie die Perfusion mit dem gesamten 50 ml Volumen von HBSS durch die Leber, in den nächsten 5 min. Ändern Sie die Kollagenase, die Medium (Schritt 1.2) enthält, in das Becherglas, kurz bevor die HBSS zu laufen beginnt. Stellen Sie sicher, dass Luftblasen nicht vorhanden sind und nicht in die Leber fließen, wenn das Medium gewechselt wird. Wenden Sie den transienten Druck auf den IVC in 5 s Intervallen an, indem Sie mit Zangen klemmen. Dies wird dazu führen, dass die Leber anschwellen und bei der Gewebeverdauung und Dissoziation helfen (7-8 min). Mit fortschreitender Verdauung wird die Leber anschwellen und weiß werden. Die Leber kann gleichmäßig auf etwa das Doppelte ihrer ursprünglichen Größe anschwellen. Schalten Sie die Pumpe aus und entfernen Sie die Kanüle, sobald die Verdauung abgeschlossen ist. Die Vollendung der Leberverdauung hängt von der Größe der Maus und dem Zustand der Leber ab. Eine Delle in der Leber kann beobachtet werden, wenn ein Baumwoll-Applikator verwendet wird, um die Leber sanft zu untersuchen. Entfernen Sie die Gallenblase aus der Leber, achten Sie darauf, sie nicht zu reißen. Mit einer gewaschenen Schere und Zange die Leber aus der Maus in eine sterile 10 cm Kulturschale mit Phosphat-gepufferter Saline (PBS) für die Oberflächenwäsche extrahieren. Übertragen Sie die Leber vorsichtig in die sterile 10 cm Kulturschale mit Kollagenasemedium (ab Schritt 1.8). Dies ist ein wichtiger Schritt, um eine Kontamination durch das Blut und die Galle der Maus zu vermeiden. Schnappen und zerreißen Sie die Leber mit zwei sauberen Zangen, während sie sanft die Zellen aus der Leber schütteln. Wenn dies geschieht, wird das Medium getrübt. Alle Hepatozyten können weggeschüttelt werden und hinterlassen das Binde- und Gefäßgewebe. Trituieren Sie die Zelllösung mehrmals mit einer 3 ml Spritze, bis die unverdauten Teile der Leber abgeschüttelt werden. Gießen Sie es in ein 50 ml konisches Rohr mit 70 ‘m Nylon-Zellsiebe, um jedes unverdaute Bindegewebe zu filtern. Waschen Sie die Schale mit HBSS, um die restlichen Zellen zu sammeln und füllen Sie die 50 ml konische Röhre. Zentrifugieren Sie das 50 ml konische Rohr in einem schwingenden Schaufelrotor bei 50 x g für 10 min bei 4 °C weich. Übertragen Sie den Überstand auf ein neues 50 ml kegelförmiges Rohr. 4. Isolierung von Elektrofahrzeugen (5 h) Zentrifugieren Sie den Überstand bei 300 x g für 10 min bei 4 °C. Übertragen Sie den Überstand in ein neues 50 ml kegelförmiges Rohr. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 2000 x g für 20 min bei 4 °C, um Zellablagerungen und Aggregate zu entfernen. Übertragen Sie den Überstand auf ein rund-unteres Rohr und zentrieren Sie den Überstand bei 10.000 x g für 70 min bei 4°C. Den Überstand sammeln und bei 4 °C 70 min in ein Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr und eine Zentrifuge bei 100.000 x g geben. Sammeln Sie das Pellet in einem Ultrazentrifugenrohr, das dann durch erneutes Aufhängen in PBS gewaschen wird. Zentrifugieren Sie den Überstand bei 100.000 x g bei 70 min bei 4 °C weiter. Das endige Pellet aus zellulären Nanovesikeln kann direkt für Experimente verwendet oder mit 1000 l PBS wieder aufgehängt und bei -80 °C gelagert werden. 5. Bewertung der Qualität und des Ertrags von Isolationen Bewerten Sie die Größenverteilung und -konzentration anhand von Nanopartikel-Tracking-Analysen oder einer einstellbaren Widerstandspulserfassung nach den Protokollen des Geräteherstellers. Führen Sie eine weitere Isolierung und Reinigung bestimmter Vesikelpopulationen durch verschiedene Ansätze durch, wie z. B. die Zugabe eines Saccharosegradienten oder Kissens, Immunaffinitätstechniken oder Größenausschlusschromatographie, basierend auf spezifischen experimentellen Bedürfnissen.

Representative Results

Die für diese Isolierungen benötigten Geräte bestehen aus Standard-Laborgeräten, was dies zu einem relativ einfachen und kostengünstigen Ansatz macht. Isolationen wurden von zwölf- bis dreißig Wochen alten männlichen und weiblichen Balb/c- oder FVB-Mäusen durchgeführt. Das Tablett, das die Maus hält, ist mit Aluminiumfolie in einem hartwandigen Behälter ausgekleidet, der überschüssige Flüssigkeiten während der Perfusion sammelt. Die HBSS- oder Kollagen-haltigen Kolben werden in ein gebrauchsfertiges Wasserbad (40 °C) getaucht. Es werden zwei sterile 10 cm Kulturgerichte verwendet. Eines wird für die Oberflächenwäsche mit PBS benötigt, das andere für die Hepatozytentrennung von den Bindegewebskomponenten. Bei dieser Methode wird die Leber in einer nicht-kontinuierlichen Weise über die Portalvene vor der Konservenbildung aus der unteren Vena cava durchdrungen. Ein alternativer und häufig verwendeter Perfusionsansatz besteht darin, eine retrograde Perfusion durchzuführen, indem die untere Vena cava konnaguliert und die Portalvene für die Drainage geschnitten wird. Die Portalvenenkanulation ist jedoch leicht zugänglich und beinhaltet eine kurze Entfernung zur Leber, da die Portalvene direkt in die Leber einfließt8. Die Auswahl einer Einfügemarke für die Kanulation ist entscheidend für den optimalen Erfolg (Abbildung 2). Die Kanüle wird an den Zweigen der Magen- und Bauchspeicheldrüsenadern vorbeigelegt, aber nicht über den ersten Portalzweig (rechte und linke Leberportalader). Sobald die optimale Einfügeposition in der Portalvene identifiziert ist, werden gekrümmte Zangen verwendet, um einen Faden unter die Portalvene zu legen und einen losen Knoten zu binden. Die Nadel der Kanüle wird mit Gewinde mit einem Stopfenknoten fixiert, um zu verhindern, dass die Nadel herausfällt. Abbildung 3 zeigt das Gesamtverarbeitungsschema für die Differentialzentrifugation für die Isolierung von Lebergewebe-EVs. Ultrazentrifugation entfernt Zellen, Schmutz und andere Verunreinigungen. Die ersten vier Zentrifugationsschritte (50 x g, 300 x g, 2.000 x g, 10.000 x g) sind so konzipiert, dass Hepatozyten, intakte andere Zellen, abgestorbene Zellen bzw. Zellablagerungen entfernt werden. (Abbildungen 4A und 4B). Nach diesen Schritten wird die Ultrazentrifugation wieder bei 100.000 x g durchgeführt, um das Pellet zu sammeln (Abbildung 4C). Das Pellet wird durch erneutes Aufhängen in PBS gewaschen und einer endgültigen Ultrazentrifugation bei 100.000 x g unterzogen. Das Pellet nach der Ultrazentrifugation ist in diesem Verfahren absolut sichtbar und viszid im Vergleich zu Elektrofahrzeugen aus konditionierten Kulturmedien. Das Pipettieren ist oft erforderlich, bis braune Aggregate nicht mehr in Sicht sind und vollständig aufgelöst sind. Das endige Pellet wird mit 1000 l PBS (Abbildung 4D) wieder aufgehängt. Ultrazentrifugation entfernt Verunreinigungen und andere lösliche Verunreinigungen aus dem Plasma, die funktionelle experimentelle Ergebnisse beeinflussen können. Die Zentrifugation erfolgt bei 4 °C. Von der Mausleber ergibt diese Methode eine Gewebe-EV-Konzentration, die von 1,74 bis 4,00 x 1012 mit einem Mittelwert von 3,46 x 1012 Partikeln pro ml reicht, wie durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) bestimmt (Abbildung 5). Die mittlere Größe der isolierten Lebergewebe-EVs betrug 157,7 nm, mit einer Modusgröße von 144,5 nm und EV-Größen von 100-600 nm von NTA. Die Ausbeute von EV hängt von Faktoren wie dem Lebergewicht und Verlusten innerhalb der Perfusaten- oder Ultrazentrifugationsschritte ab. Abbildung 1 : Bankvorbereitung. Die Materialien und ihre Standorte sind: (A) Pumpe, (B) erwärmt125 ml Kolben mit HBSS und Wassersauganschluss, (C) Nasenkegel mit einem Isoflurane-Verdampfer verbunden, (D) Wasserabluftanschluss der Pumpe, die mit Nadel verbunden ist, (E) Mit Aluminiumfolie ausgekleidet hartwandigen Behälter und (F) 10 cm Kulturschale, in die Kollagenase Medium im Voraus gegossen wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2 : Cannulation-Site. Die Anatomie des Mausbauchs wird gezeigt. Mit gekrümmten Zangen wird ein Faden unter der Portalvene (PV) platziert und ein lockerer Knoten gebunden. Die Einfügeposition befindet sich in der Nähe der Leber, 5-10 mm unter der Ligatur, aber nicht hinter dem ersten Portalzweig (linke und rechte Leberportalader). Die Kanüle wird mit Gewinde mit einem Stopperknoten fixiert oder befestigt. Dieser Knoten dient als Markierung des PV-Standorts, wenn die Kanüle entfernt wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3 : Schematic der Zentrifugationsschritte. Ziel ist es, unerwünschte Zellen und andere Komponenten zu entfernen und Elektrofahrzeuge zu isolieren. Die ersten vier Zentrifugationsschritte sind darauf ausgelegt, Hepatozyten und andere Zellen, abgestorbene Zellen oder Zellablagerungen mittels Differentialzentrifugation zu entfernen. Nach diesen Schritten wird eine Ultrazentrifugation mit 100.000 x g durchgeführt, um das Pellet von Elektrofahrzeugen zu sammeln. Das Pellet wird durch erneutes Aufhängen in PBS gewaschen und einer endgültigen Ultrazentrifugation bei 100.000 x g unterzogen. Alle Zentrifugationsschritte werden bei 4 °C durchgeführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4 : Differentialzentrifugation. (A) Nach der Zentrifugation bei 50 x g für 10 min wird ein Pellet beobachtet, das Hepatozyten enthält. (B) Zur Zentrifugation mit 10.000 x g wird 70 min ein Rundbodenrohr verwendet, um Zellablagerungen zu entfernen. (C) Für die Zentrifugation bei 100.000 x g wird für 70 min ein Polycarbonat-Ultrazentrifugenrohr verwendet. Das Pellet wird in einem Rohr gesammelt und durch erneutes Aufhängen mit PBS gewaschen. (D) Das endgültige Pellet wird in 1000 l PBS wieder aufgehängt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5 : Repräsentatives Ergebnis. Die Größe und Konzentration von Lebergewebe-EVs kann durch Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) bestimmt werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Dieses Protokoll beschreibt eine optimale und reproduzierbare Methode zur Isolierung von Lebergewebe-EV mit einem zweistufigen Perfusionsprozess über die Portalvene gefolgt von differentialer Ultrazentrifugation. Wichtige Schritte des Verfahrens sind Kanülenplatzierung, Kollagennasekonzentration und Verdauungszeit, Fließgeschwindigkeit des Mediums, Handhabung des Gewebes nach der Verdauung und klassische Differential-Ultrazentrifugation.

Die Zelltrennung wird durch Trennung von Bindegewebskomponenten nach der Verdauung mit Kollagenase Typ IV erreicht. Die Konzentration der kollagennase, die für die Perfusion verwendet wird, kann zwischen 0,1 und 5 mg/ml liegen. Es kann erhebliche Batch-to-Batch-Variation enderart in der Wirksamkeit von Kollagenase für die Gewebeverdauung geben. Es wurden Konzentrationen von Kollagenase von 0,5 bis 5 mg/ml getestet, aber die verwendete Konzentration hatte keinen großen Einfluss auf die Ausbeute der erhaltenen Elektrofahrzeuge. Die Verwendung einer höheren Konzentration von Kollagenase führt zu einer schnelleren Schwellung und Aufhellung der Leber. Ziel ist es, eine zufriedenstellende Zelldissoziation ohne übermäßige Kontamination oder Beschädigung zu erreichen. Eine optimale Konzentration der Kollagenase, die in diesen Isolierungen verwendet wird, beträgt 1-2 mg/ml, die für 7-8 min bei einer Durchflussrate von 8 ml/min durchsetzt ist. Ein zu langes Perfusionsverfahren erhöht das Risiko, das dünne Bindegewebe in der Leber zu zerstören, sowie die technischen Risiken wie Nadelablösung aus der Portalvene oder Luftfang mit der Vene.

Der schwierigste Aspekt dieses Protokolls ist die Cannulation der Portalvene. Dies kann eine Herausforderung sein, insbesondere bei Mäusen im Größenbereich von 18 bis 25 g. Die Techniken zur Kollagenaseperfusion wurden ursprünglich für den Einsatz bei Ratten entwickelt und anschließend nach zahlreichen Modifikationen und Anpassungen für den Einsatz bei Mäusen übernommen. Die Cannulation mit einem 23G-Blutentnahmeset ist einfacher als die Platzierung eines Katheters in Blutgefäßen mit kleinem Luminaldurchmesser. Die Befestigung der Kanüle mit Gewinde mit einem Stopperknoten wird empfohlen, um eine Verdrängung zu vermeiden, und der Knoten dient auch als Marker der Portalvenenposition für den Fall, dass die Kanüle aus dem Gefäß kommt.

Für die nachgelagerte Analyse ist es äußerst wichtig, eine minimale Kontamination durch Zellen zu haben. Es gibt mehrere wichtige Überlegungen im Umgang mit Gewebe nach der Verdauung. Zuerst werden die Zange und die Schere gewechselt, wenn die Leber extrahiert wird, um eine Blutkontamination zu vermeiden. Zweitens ist es wichtig, dass die Gallenblase sorgfältig aus der Leber entfernt werden, um Reißen und unerwünschte Kontamination von Galle zu vermeiden. Drittens, sobald die Leber von der Maus entfernt wurde, wird die Leber sehr sanft mit PBS gewaschen, um blutbildende Blut zu entfernen. Die Minimierung der Kontamination mit Zellen sollte eine höhere Priorität erhalten als die Verringerung der Ausbeute der erhaltenen Elektrofahrzeuge.

Ultrazentrifugation ist die am häufigsten verwendete Methode zur Isolierung und Reinigung von Elektrofahrzeugen8,9,10,11. Dieser Ansatz entfernt die meisten parenchymalen Zellen wie Hepatozyten oder Cholangiozyten und nicht-parenchymale Zellen wie Kupffer-Zellen, sinusförmige Endothelzellen und stellate Zellen. Darüber hinaus werden Zellablagerungen, Zellaggregationen und abgestorbene Zellen durch Differentialzentrifugation entfernt werden. Weitere Reinigung und Isolierung bestimmter Populationen kann durch Größenausschlusschromatographie durchgeführt werden, um nicht-vesikuläre Proteinaggregate oder Lipoproteine zu entfernen.

Eine Einschränkung dieses Protokolls ist, dass es nicht alle Gewebebläschen erfassen kann, angesichts der Möglichkeit, dass einige Vesikel in der Perfusate entfernt werden können. Wenn eine globale Bewertung erforderlich ist, sollte die Sammlung von Perfusate und die Isolierung von Vesikelinnerhalb innerhalb von Perfusate in Betracht gezogen werden. Eine weitere Einschränkung ist das Potenzial für Zellschäden. Um die möglichen Auswirkungen eines übermäßigen Zelltodes zu überwachen, kann die Zelllebensfähigkeit überwacht und in Qualitätsparameter für Gewebe-EV-Isolierungen integriert werden. Zusammenfassend beschreibt dieses Verfahren einen optimierten Workflow mit einer zweistufigen Perfusionstechnik über die Portalvene gefolgt von einer differenziellen Ultrazentrifugation zur Gewinnung von Lebergewebe-EVs von Mauslebern mit hoher Ausbeute. Diese Gewebe-EVs eignen sich für nachgelagerte Analysen wie die Charakterisierung biomolekularer Zusammensetzung und andere Studien, die ihre physiologischen oder pathophysiologischen Rollen oder mögliche Anwendungen als Krankheitsmarker charakterisieren sollen.

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Studie wurde durch Fördermittel des National Cancer Institute Grant CA-217833 unterstützt.

Materials

125 mL Erlenmeyer flask Fisher scientific FB500125
125 mL Erlenmeyer flask Fisher scientific FB500125
Curved non-serrated scissors Fine Science Tools 14069-12
Curved forceps Fine Science Tools 13009-12
Masking tape Home supply store
Aluminum foil Home supply store
Styrofoam pad Home supply store
Absorbent Bench Underpad Scientific inc. B1623
Masterflex L/S Digital Miniflex Pump Cole-parmer ZX-07525-20
Water bath Thermo Electron Precision 2837
Blood collection sets Becton Dickinson 367292
Petri dish, clear lid 100×15 Fisher Scientific FB0875712
Falcon 70mm Nylon Cell Strainers Fisher scientific 352350
50 mL conical tubes Fisher Scientific 12-565-270
Cotton Tipped Applicators Moore medical 69622
25mL Serological Pipet Falcon 357525
Ohmeda Isotec 4 Isoflurane Vaporiser BioSurplus 203-2751
O2 gas
Isoflurane
 Levo Plus Motorized Pipette Filler Scilogex 74020002
Centrifuge 5804R Sigma-aldrich 22628048
Beckman Coulter Optima L-100 XP Beckman 969347
Beckman Coulter Avanti JXN-26 Beckman B34182
70 Ti Fixed-Angle Rotor Beckman 337922
JA-25.50Fixed-Angle Rotor Beckman 363055
Nalgene Round-bottom tube Thermo Scientific 3118-0028
Polycarbonate ultracentrifuge tubes with cap assembly Beckman 355618
Reagents
HyClone Hank's Balanced Salt Solution (HBSS), Ca/Mg free Fisher scientific SH30588.01
Collagenase, Type IV, powder Fisher scientific 17104019
Phosphate Buffered Saline (PBS) Fisher scientific SH30256.01
DOWNLOAD MATERIALS LIST

参考文献

  1. Kogure, T., Lin, W. L., Yan, I. K., Braconi, C., Patel, T. Intercellular nanovesicle-mediated microRNA transfer: a mechanism of environmental modulation of hepatocellular cancer cell growth. Hepatology. 54 (4), 1237-1248 (2011).
  2. Maji, S., Matsuda, A., Yan, I. K., Parasramka, M., Patel, T. Extracellular vesicles in liver diseases. American Journal of Physiology – Gastrointestinal and Liver Physiology. 312 (3), 194-200 (2017).
  3. Kogure, T., Patel, T. Isolation of extracellular nanovesicle microRNA from liver cancer cells in culture. Methods in Molecular Biology. 1024, 11-18 (2013).
  4. Miller, L. L., Bly, C. G., Watson, M. L., Bale, W. F. The dominant role of the liver in plasma protein synthesis; a direct study of the isolated perfused rat liver with the aid of lysine-epsilon-C14. Journal of Experimental Medicine. 94 (5), 431-453 (1951).
  5. Seglen, P. O. Preparation of isolated rat liver cells. Methods in Cellular Biology. 13, 29-83 (1976).
  6. Klaunig, J. E., et al. Mouse liver cell culture. I. Hepatocyte isolation. In Vitro. 17 (10), 913-925 (1981).
  7. Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. Isolation and culture of adult mouse hepatocytes. Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).
  8. Yin, Z., Ellis, E. C., Nowak, G. Isolation of mouse hepatocytes for transplantation: a comparison between antegrade and retrograde liver perfusion. Cell Transplantation. 16 (8), 859-865 (2007).
  9. Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Currents Protocols in Cell Biology. , (2006).
  10. Raposo, G., et al. B lymphocytes secrete antigen-presenting vesicles. Journal of Experimental Medicine. 183 (3), 1161-1172 (1996).
  11. Witwer, K. W., et al. Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).

タグ

Extracellular VesiclesLiverPortal Vein CannulationHBSS PerfusionCollagenase Digestion

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
記事を引用
Ishiguro, K., Yan, I. K., Patel, T. Isolation of Tissue Extracellular Vesicles from the Liver. J. Vis. Exp. (150), e58649, doi:10.3791/58649 (2019).
引用ダウンロード
転載と許可

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image