组织细胞外囊泡与肝脏分离

所有涉及动物的研究都按照梅奥诊所机构动物护理和使用委员会批准的协议进行。 1. 工作台准备 准备一个水浴，并将其设置为37°C。其他必要的设备和设置如图1所示。 测量 100 mg 的胶原酶 IV 型，并将其添加到水浴 （40 °C） 中含有 100 mL HBSS 的 125 mL 烧瓶中。确保胶原酶通过搅动烧瓶中的液体溶解，并确保烧瓶完全浸入水浴中。为了提高效率，允许胶原酶溶解至少30分钟，即使它可能看起来立即溶解。 将含有 50 mL HBSS 的 125 mL 烧瓶浸入 40°C 的水浴中。这将用于初始刷新。 用70%乙醇喷洒所有仪器的表面，如剪刀和钳子。准备一些干净的棉签。 通过泵中 70% 乙醇，冲洗泵的油管，然后用自来水冲洗两次，去除任何残留的乙醇。 在实验室工作台上放置一个吸水式工作台垫，并将一个硬箱容器放在顶部。在小鼠灌注过程中，需要包含任何多余的液体。用铝箔包裹聚苯乙烯泡沫垫，并将其放入容器内。 将无菌的 10 厘米培养皿放在长凳附近。灌注完成后，这将用于保存消化的肝脏。 提前将10 mL的胶原酶培养基（步骤1.2）倒入无菌培养皿中。 使用带翼的血液采集组，将 23 号表连接到泵管的自由端（切断蝴蝶管的翅膀可以导致更好的操作）。通过，直到血液收集管的尖端被填补。 2. 动物准备 在开始使用异曲兰麻醉之前，请确保在手术过程中有足够的供气。在 1-2L 处打开感应室的氧气 （O 2） 供应，然后使用流量计在 2-4% 之间打开开的开路。 将鼠标放入感应室并关闭顶门。监视鼠标，直到其卧塞。注：室内的气体会使小鼠麻醉几分钟。 将鼠标放在用铝箔包裹的聚苯乙烯泡沫垫上。将流量从感应室切换到锥体。确保麻醉充足。如果鼠标开始响应，轻轻地将其抑制在鼻锥中，直到完全麻醉。 通过监测呼吸和对手术过程中的刺激反应来确保麻醉。根据需要调整速率流量计，以确保充分麻醉。爪子必须对麻醉下的捏合测试没有反应。其他详情可从动物护理实验室指南中获得。 胶带或固定鼠标的所有四肢。 用70%乙醇喷洒，用纱布和酒精垫擦去，清洁腹部皮肤。此步骤对于避免小鼠毛皮污染至关重要。 使用一套无菌剪刀，从前部到骨盆骨，在皮肤上进行宽开的切割。小心不要割断任何内脏器官。使用棉倒施用器将肠道转移到动物的左侧，轻轻露出入口静脉 （PV） 和低劣的 vena 卡瓦 （IVC）。 3. 灌注和灌注（0.5小时） 使用弯曲的钳子，在门静脉下面放置一个螺纹，并松散地打结，准备在咬紧后紧紧扣住。 将管状（从血液采集集中的 23G）插入连字下方 5-10 mm 的门户静脉中。请勿将导管插入第一个门户分支，否则右前叶可能未充分注入。管状可以使用塞结固定或用螺纹固定。 启动泵以低流量（1-2 mL/min）注入 HBSS。一旦罐被确认是成功的，肝脏将开始发泡。 切断 IVC 以释放压力，让肝脏内的过多液体排出。最好使用另一只手操作，以便不移动导管。 在接下来的5分钟内，缓慢地将流速提高到8 mL/min，并使用整个50 mL的HBSS体积通过肝脏完成灌注。 在 HBSS 开始耗尽之前，将含有介质的胶原酶（步骤 1.2）放入烧杯中。更换介质时，确保气泡不存在，且不会流入肝脏。 用钳子夹紧，每隔 5 秒对 IVC 施加瞬态压力。这将导致肝脏膨胀，帮助组织消化和解散（7-8分钟）。随着消化的进展，肝脏会膨胀并变白。肝脏可以均匀膨胀到大约其原始大小的两倍。 消化完成后，关闭泵并拆下导管。肝脏消化的完成将取决于小鼠的大小和肝脏的状况。如果使用棉签施用器轻轻探查肝脏，则可以观察到肝脏的凹痕。 从肝脏中取出胆囊，小心不要撕裂。使用一把洗过的剪刀和钳子，从小鼠中提取肝脏到含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）的无菌10厘米培养盘中，用于表面清洗。小心地将肝脏转移到含有胶原酶培养基的无菌 10 厘米培养盘中（从步骤 1.8 开始）。这是避免小鼠血液和胆汁污染的关键步骤。 抓住和撕开肝脏与两个干净的钳子，同时轻轻地摇动细胞从肝脏。发生这种情况时，介质将变得阴云密布。所有的肝细胞都可以被动摇，留下结缔组织和血管组织。 使用 3 mL 注射器多次对细胞溶液进行三聚，直到肝脏未消化的部分被甩掉。将其倒入50 mL锥形管中，带70 μm尼龙细胞过滤器，以过滤任何未消化的结缔组织。用 HBSS 清洗盘子，收集剩余的细胞，并填充 50 mL 锥形管。 在 50 x g 的摆动铲斗转子中轻柔地将 50 mL 锥形管离心 10 分钟，在 4°C 下。 将上清液转移到新的 50 mL 锥形管中。 4. EV 隔离（5 小时） 在 4°C 下在 300 x g下离心 10 分钟。将上清液转移到新的 50 mL 锥形管中。 在 2000 x g下将上清液在 4°C 下离心 20 分钟，以清除细胞碎屑和集料。 将上清液转移到圆底管中，在 4°C 下以 10，000 x g 将上清液离心 70 分钟。 收集上清液，并放入聚碳酸酯超离心管和离心机在100，000 x g在4°C70分钟。 将颗粒收集在超离心管中，然后在PBS中重新悬浮洗涤。在 4°C 下，在 100，000 x g 下进一步离心，70 分钟。 由细胞纳米囊组成的最终颗粒可直接用于实验或重新悬浮1000μL的PBS，并储存在-80°C。 5. 隔离的质量和产量评估 根据仪器制造商的协议，使用纳米粒子跟踪分析或可调电阻脉冲感应来评估尺寸分布和浓度。 根据特定的实验需求，通过添加蔗糖梯度或缓冲、免疫亲和力技术或尺寸排除色谱等多种方法，对特定囊泡种群进行进一步分离和纯化。