Photobleaching은 Cyanobacterium Prochlorococcus 에서 FtsZ 반지의 슈퍼 해상도 이미징 가능
概要
여기 우리는 박테리아의 autofluorescence를 줄이기 위해 photobleaching 메서드를 설명 합니다. Photobleaching, 후 확률적 광학 재건 현미경 cyanobacterial FtsZ 반지의 3 차원 슈퍼 해상도 이미지를 얻을 하는 데 사용 됩니다.
Abstract
슈퍼 해상도 현미경은 단백질 상호 작용 및 많은 유기 체에서 subcellular 구조 연구에 널리 사용 되었습니다. 그러나 광합성 유기 체,, 슈퍼 해상도 영상의 가로 해상도만 ~ 100 nm. 낮은 해상도 확률적 광학 재건 현미경 (폭풍) 등 슈퍼 해상도 영상에 필요한 고 강도 레이저에 의해 발생 하는 광합성 세포의 높은 autofluorescence 배경 때문 이다. 여기, 우리는 photobleaching 기반 폭풍 방법을 개발 된 최근 해양 picocyanobacterium Prochlorococcus이미징 기술. Photobleaching, 후 Prochlorococcus 의 autofluorescence는 효과적으로 감소 그 폭풍 ~ 10의 측면 분해능으로 수행할 수 있도록 nm. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 FtsZ 단백질의 조직에 vivo에서 3 차원 (3 차원)을 취득 하 고 Prochlorococcus의 세포 주기 동안 4 개의 다른 FtsZ 반지 형태학 특성. 우리는 여기에 설명 하는 방법 다른 광합성 유기 체의 슈퍼 해상도 이미징에 대 한 채택 될 수도 있습니다.
Introduction
슈퍼 해상도 microscopies 빛의 회절 한계를 휴식 하 고 하위 회절 해상도 (< 200 nm) 내에서 이미지를 제공할 수 있습니다. 그들은 널리 사용 되었습니다 많은 유기 체에서 단백질 지 방화 및 subcellular 구조 공부 하. 슈퍼 해상도 현미경 방법 등 구조화 조명 현미경 (SIM)를 주요 자극 방출 소모 현미경 (호텔 위치), 폭풍, 그리고 photoactivated 지역화 현미경 검사 법 (종 려). 메커니즘 및 응용 프로그램의 이러한 슈퍼 해상도 현미경 되었습니다 다른1,2검토.
폭풍 10 높은 해상도 달성할 수 있다 공간 분리3,4nm. 폭풍, 회절 제한 된 지역 내에서 하나의 분자 (“에”) 활성화 되 고 분자의 나머지 (“off”) 사 유지 됩니다. 단일 분자의-와 급속 한 스위치에의 축적, “회절 무제한” 이미지 생성된3수 있습니다. 한편, 많은 종류의 유기 염료 및 형광 단백질 고해상도 현미경5,6일반 형광 현미경 검사 법에서 쉽게 업그레이드할 수 있도록 폭풍에 적용 됩니다.
폭풍은 널리 적용 되지 광합성 세포, 박테리아, 조류, 등에서 하며 식물 세포 엽록체7,8, 사실 그 폭풍은 드라이브 photoswitching 높은 레이저 강도. 고 강도 레이저 형편이 나쁘게 광합성 세포에 강한 autofluorescence 배경 흥분 하며 폭풍 영상에서 단일 분자 지역화 방해 합니다. 폭풍우를 사용 하 여 subcellular 구조 또는 광합성 세포에 있는 단백질 상호 작용을 조사 하려면, 우리는 배경 autofluorescence 신호9를 풀기 위해 photobleaching 프로토콜을 개발 했다. 일상적인 immunofluorescent 얼룩 절차에서는 표본 단계에서 차단, 폭풍에 대 한 요구 사항에 맞게 광합성 세포의 autofluorescence를 절감 하 고 강도의 하얀 빛에 노출 됩니다. 따라서,이 프로토콜은 폭풍 안료 생물 조사 가능 합니다.
여기, 우리는 폭풍 FtsZ 반지 조직 단 세포 picocyanobacterium Prochlorococcus에서 이미지를 사용 하 여 프로토콜을 설명 합니다. FtsZ 반지 구조 (Z 반지) 셀10 의 둘레를 polymerizes 이며11세포 분열 필수적인 매우 보존된 tubulin 같은 cytoskeletal 단백질 이다. Prochlorococcus 유지은 autofluorescent 배경 및 기본 안티-FtsZ 항 체와 immunostained을 줄이기 위해 첫 번째 photobleached와 보조 반대로 토끼 (H + L) IgG 항 체는 fluorophore와 활용은 다음 (예: , 알 렉 사 Fluor 750). 결국, 폭풍우는 다른 세포 주기 단계 동안 Prochlorococcus 에서 자세한 FtsZ 반지 단체를 관찰 하는 데 사용 됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜에서 설명 하는 cyanobacterium Prochlorococcus (그림 3C)의 autofluorescence를 크게 감소 하는 절차와, 다음, immunostain 공부 3 차원 FtsZ 폭풍을 활용 수 있게 세포에 있는 단백질 반지 Prochlorococcus (그림 4)에서 형태학. 이 프로토콜은 슈퍼 해상도 영상 다른 광합성 유기 체에 대 한 채택 될 수도 있습니다.
광합성 유기 체에…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 그녀의 기술 지원 및 원고에 대 한 의견 Daiying 쑤 감사합니다. 이 연구는 국립 자연 과학 재단의 중국 (프로젝트 번호 41476147)에서 교부 금 및 연구 보조금 위원회는 홍콩 특별 행정구, 중국 (프로젝트 번호 689813 및 16103414)의 의해 지원 됩니다.
Materials
| Polystyrene particles | Spherotech | PP-20-10 | 2.0-2.4 µm |
| Coverslip | Marienfeld | 0111580 | 18 mm ∅, Thickness No. 1 |
| Ethanol | Scharlau | ET00021000 | |
| Poly-L-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P9155 | mol wt 70,000-150,000 |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Glutaraldehyde solution, 50% | Sigma-Aldrich | 340855 | |
| PBS | Sigma | P3813 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| EDTA Disodium Salt, 2-hydrate | Gold biotechnology | E-210-500 | |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| Goat serum | Sigma | G9023 | |
| anti-Anabaena FtsZ antibody | Agrisera | AS07217 | |
| Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody | Life Technologies | A-21039 | conjugated with Alexa Fluor 750 |
| D-Glucose Anhydrous | Fisher Scientific | D16-1 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Methyl Viologen | Sigma-Aldrich | 856177 | |
| Cyclooctatetraene | Sigma-Aldrich | 138924 | |
| tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) | Sigma-Aldrich | 646547 | |
| Glucose Oxidase | Sigma-Aldrich | G2133 | |
| Catalase | Sigma-Aldrich | C9322 | |
| XD-300 Xenon light source | 250 W | ||
| STORM microscope | NBI | SRiS microscope | |
| Rohdea | NBI | SRiS 3.0 | software for imaging acquisition |
| Luna | NBI | SRiS 3.0 | software for drifting correction |
| QuickPALM | https://code.google.com/archive/p/quickpalm/wikis | ||
| 3D Viewer | http://132.187.25.13/ij3d/?page=Home&category=Home |
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