Una purificación y análisis de actividad In Vitro de una (p) ppGpp sintetasa de Clostridium difficile

Enzimas quinasa y pyrophosphokinase (o diphospho-quinasa) transferencia de fosfatos a partir de precursores de nucleótidos trifosfato (NTP) a las moléculas de sustrato. Los sustratos pueden incluir otros nucleótidos, aminoácidos o proteínas, carbohidratos y lípidos¹. Análisis Bioinformático a veces pueden predecir una enzima cognada sustrato o sustratos basados en la semejanza a las enzimas caracterizadas, pero validación experimental sigue siendo necesario. Del mismo modo, la afinidad de una enzima para sus substratos y la tasa a la que cataliza la reacción de transferencia de fósforo y los efectos de factores inhibidores y otros efectores de la enzima deben ser determinada experimentalmente. Para evitar el agotamiento del precursor del ATP por otras enzimas ATP-consumo presentes en el citoplasma bacteriano, ensayos de actividad cuantitativa requieren proteínas purificadas.

Purificación de proteínas por cromatografía de afinidad metálica ha sido cubierto completamente en la literatura^2,3. Etiquetas de la histidina que consta de seis residuos de histidina consecutivos anexados a la N – o C-terminal de una proteína recombinante permiten rápida purificación por cromatografía de afinidad metálica^4,5,6. Estas secuencias son pequeñas comparadas a las proteínas modifican y suelen tener un efecto mínimo en función de la proteína, aunque a veces puede alterar la estabilidad de la proteína o enzima cinética^7,8. Etiquetas de histidina en la N – y C-termini de la misma proteína pueden tener diversos efectos, que son difíciles de predecir sin conocer la estructura de la proteína en cuestión. Etiquetas de la histidina se incorporan típicamente durante la clonación de una proteína recombinante mediante el diseño de primers que codifican seis residuos de histidina, ya sea inmediatamente 3′ al codón de inicio ATG o inmediatamente 5′ al codón de parada del marco abierto de lectura. Después de la amplificación, el gen que contiene hexahistidine es ligado en un vector bajo el control de un promotor inducible y expresado, típicamente en una cepa de laboratorio de e. coli. La proteína de recombinación entonces puede ser aislada en una resina de afinidad que contienen cationes divalentes inmovilizados (generalmente níquel o cobalto)⁹. Natales metal vinculante proteínas contaminantes pueden eliminarse por titulación con imidazol, que desplaza competitivamente proteína encuadernada². Finalmente, la proteína Diana es eluida de la columna con altas concentraciones de imidazol. Hay varias fuentes comerciales para las resinas de catión metal inmovilizados, y los fabricantes ofrecen recomendaciones para las condiciones de buffer y concentraciones de imidazol. Después de elución, la proteína puede ser analizada por electroforesis del gel de la sulfato-poliacrilamida de sodio dodecyl (SDS-PAGE), dializaron o utilizada inmediatamente en análisis funcionales.

Hay varios métodos para monitorear indirectamente actividad quinasa por acoplamiento hidrólisis de enlace de fosfato de ATP a una segunda reacción que libera o excita un fluoróforo o genera la quimioluminescencia, pero estas reacciones tienen varias partes móviles y pueden ser logísticamente difíciles¹⁰. La manera más directa para medir específicamente la actividad de transferencia de fósforo es monitorizar directamente la transferencia de un grupo fosfato radiomarcada de un γ disponibles comercialmente –³²-P precursor NTP a un sustrato no radiactiva^{11 , 12 , 13}. mezclas de sustratos radiactivos y productos pueden ser separados y cuantificados por cromatografía en capa fina (TLC). TLC utiliza la movilidad diferencial de los solutos en un solvente dado, permitiendo que el solvente (fase líquida) que migra por acción capilar a través de una superficie (fase sólida) sobre el cual una mezcla de solutos ha sido adsorbido¹⁴. Solutos que son pequeñas y carecen de interacciones favorables con la fase sólida se migran largas distancias desde su ubicación inicial a solutos con peso molecular mayor o gran afinidad por el sólido. Para el examen de transferencia de fósforo, partes de fosfato aumentan el peso molecular de las moléculas que se agregan a y agregar la carga iónica negativa a pH neutro o acídico^11,12,14. Esto disminuye su movilidad sobre superficies básicas como PEI-celulosa. Cuando se convirtió en tampón de fosfato ácido de potasio, mezclas de mono-, di-, tri-, tetra- y especies pentaphosphate pueden dividirse fácilmente en PEI-celulosa, permitiendo la cuantificación de cada especie (figura 2, figura 3). Estos ensayos se pueden realizar lysates de la célula que contiene la enzima de interés, pero esto incluye el potencial de la actividad de otras quinasas, fosfatasas y ATPasas general a agotar el sustrato o producto. Una cuantitativa en vitro la evaluación de la actividad enzimática, es necesario purificar la enzima de interés.

Guanosina tetraphosphate (ppGpp) y guanosina pentaphosphate (pppGpp) son ribonucleótido señalización moléculas formadas por la transferencia de un pirofosfato grupo de un precursor de la adenosina trifosfato (ATP), respectivamente, un difosfato de guanosina (PIB) o guanosina tetraphosphate (GTP) sustrato¹⁵. Estas señales solo ribonucleótido, conocidas colectivamente como (p) ppGpp, median una respuesta todo el celular a la tensión ambiental, conocida como la respuesta estricta en diversas especies bacterianas^15,16. Dos clases conservadas de enzimas catalizan la formación de (p) ppGpp^15,17 Rel/Spo homólogo (RSH) enzimas son ‘largo’ bifuncional (p) ppGpp sintetasa/hidrolasas, nombrado para su semejanza a la RelA y punto (p) ppGpp metabólica enzimas de Escherichia coli que contienen sintetasa, hidrolasa y dominios de regulación, mientras que el pequeño alarmone sintetasa (SAS) enzimas son monofuncionales corto sintetasas exclusivamente encontradas Gram positivas bacterias^{15, 17 , 18}. la bacteria gram positiva formadoras de esporas de Clostridium difficile codifica supuestos genes RSH y SAS¹⁹. Aquí, presentamos el análisis de la actividad inicial que confirman que la enzima de C. difficile RSH es una catalítico activa sintetasa de ppGpp (p).