染色と冬の休眠中に甘いチェリーの卵巣原基における澱粉を定量化する画像解析を組み合わせた
概要
組織化学的手法と組み合わせる画像解析システムを使用して、冬の休眠中に甘果オウトウ (セイヨウミザクラL.) 卵巣原基のデンプン含量を定量化する手法を提案します。
Abstract
微小構造におけるでんぷんの変化は、受粉から受精・結実の発症に生殖期を含むいくつかの植物発達過程における主要なイベントに関連付けられます。しかし、花芽分化の進行中にでんぷんの変化知られていない完全に、花原基の特に小さい構造のデンプン含量を定量化の難しさのために主に。ここでは、に関するさまざまなフェーズとデンプン含量の変化を可能にする顕微鏡に接続されている画像解析システムを使用して甘いチェリー (Prunus avium l.) の卵巣原基における澱粉の定量化のため手法について述べる秋から春に休眠。この目的のため、花芽の休眠状態は冬時間の別の瞬間に、制御された条件に譲渡の芽の芽の成長を評価することによって決定されます。卵巣原基における澱粉の定量化, 花芽が順番に収集、固定、パラフィンに埋め込まれた、断面、私で染色2Kl (ヨウ素-ヨウ化カリウム)。準備は顕微鏡の下で観察を行い、背景から澱粉を明確に区別する画像解析によって分析します。デンプン コンテンツ値は検討フレームの澱粉含量の推定として各画素の光学濃度の合計を考慮したステンド グラスの澱粉に対応するイメージの光学密度を測定することによって取得されます。
Introduction
温帯木本は、その成長と発展を調節することによって、季節に適応します。彼らは春と夏の間作成し、彼らは冬1で休止状態に行く秋の間に成長を停止します。休眠により低い冬の温度で生き残るために、低温春2の適切な芽のための前提条件です。温帯果実生産・林業における休眠の重要な意味は、多様な取り組みを決定し、休眠期間3を予測するにつながっています。実証実験条件と開花のデータに基づいて統計的に予測を強制的に撮影を転送するは、フルーツの木の種を推定する研究を可能にする休眠打破の日付を決定する現在のアプローチ、各品種のための要件をゾッと。ただし、生物学的プロセスに基づく休眠状態を確認する方法不明3のままです。
甘果オウトウ (セイヨウミザクラl.) などの温帯果樹の開花は年に一度が発生し、約 2 週間続きます。ただし、花を区別し、前の夏4の間に約 10 ヶ月前を開発開始します。花原基は、冬の間に芽内休眠する秋の間に成長を停止します。この期間の各品種は、適切な開花4特定温要求量を蓄積する必要があります。冬の間に芽のフェノロジーの変化の欠乏にもかかわらず花原基が、休眠中に生理活性や低温処理温度の蓄積、最近デンプン蓄積の動的な関連付けられているまたは短縮卵巣原基の細胞内で休眠決定5の新しいアプローチを提供しています。ただし、サイズが小さいと卵巣原基の場所特別な方法論が必要です。
澱粉の木本種6の主要なストレージの炭水化物であります。したがって、でんぷんの変化は彼らの開発の7、8をサポートする炭水化物を必要とする花の組織の生理活性に関連しています。生殖のプロセス中に別のキー イベントも葯減数分裂9スタイルや胚珠の受精10まで花粉管の成長など、別の花の構造の澱粉含量の変化に関連しています。組織化学的技術は、休眠中、花原基のそれぞれの特定の組織にデンプンの検出を許可します。ただし、難易度は、そのデンプン含量の組織、品種、または年間次の蓄積/減少のパターンは時間の経過や澱粉を比較するようにの定量化に残ります。これは、組織分析手法11利用の少し量のためです。代わりに、顕微鏡12にリンクされている画像解析は、植物組織の13の非常に小さいサンプルの澱粉の定量化をことができます。
カロース14、チューブ15などの植物組織内の異なったコンポーネントの含量を定量化する特定の染色領域のサイズを測定することにより澱粉の16顕微鏡と画像解析を組み合わせたアプローチは使用されました。汚れ。でんぷん用簡単に検出できるヨウ化カリウム ヨウ素を使用して (私2KI) 反応17。この方法は非常に具体的です。私2KI デンプン粒のラミナー構造内主体しの暗い青や赤茶色の色を18の澱粉のアミロース含量によってを形作る。私と染色2KI 汚れ示す澱粉と背景組織画像解析システム19による明確なデンプン検出と後続の定量化が可能との間のコントラストが適切な。この染料は化学量論が、ヨウ素の蓄積は17を変わることができる高い澱粉分子の長さに比例。したがって、ピクセルの数として表された染色領域のサイズが内容が反映されない正確に澱粉、澱粉含量の高い違いは同じようなサイズのステンド グラス エリアとフィールドの間見つけることができるので。代わりに、デンプン含量はアプリコット8,13のさまざまな組織で報告されているように、顕微鏡から得られた黒と白の画像にステンド グラスの顆粒の光学密度を測定することによって評価される場合があります。,19、アボカド10、20、およびオリーブ21。
ここで、理解と予測のための新しいツールを提供している秋から春甘果オウトウ、卵巣原基組織の澱粉含量の定量を休眠状態の測定を組み合わせた手法を説明します。生物学的メカニズムの研究に基づく休眠、休眠とリンク。
Protocol
Representative Results
Discussion
木質の多年生植物の休眠は休眠の背後にある生物学的プロセスは不明のままが果実生産の明確な含意と気候変動で森林を提示します。休眠研究は別の観点から近づくことができるが、最後の年にわたって冬の休眠の生物学的マーカーを探して研究を強めました。しかし、芽が休眠を壊れているときを示す明確な指標を見つけるほとんどの試みは失敗した3をされています。画…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、マリア ・ エレーロと Eliseo リバスを役に立つ議論のアドバイス感謝してありがとうございます。この作品は Ministerio デ Economía y Competitividad によって支えられた、欧州地域開発基金、欧州連合 [許可番号 BES 2010 037992 e. f.];セルバンテス ナシオナル ・ デ ・危惧 y テクノロジー Agraria y Alimentaria [許可番号 RFP2015-00015-00 RTA2014-00085-00、RTA2017-00003-00];大統領府・ デ ・ アラゴン -欧州社会基金、欧州連合 [Grupo Consolidado A12-17R]。
Materials
| Precision scale | Sartorius | CP225D | |
| Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
| Drying-stove | Memmert | U15 | |
| Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
| Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
| Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
| Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
| Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
| Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |
参考文献
- Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae. Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).
- Rohde, A., Bhalerao, R. P. Plant dormancy in the perennial context. Trends in Plant Science. 12 (5), 217-223 (2007).
- Fadón, E., Rodrigo, J. Unveiling winter dormancy through empirical experiments. Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).
- Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.). Trees – Structure and Function. , (2018).
- Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry. Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).
- Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots. HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiology. , (2016).
- Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca). Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).
- Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana). PLoS One. 8 (10), e78467 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Quantification of starch in plant tissues. Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).
- Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nature Methods. 9 (7), (2013).
- Rodrigo, J., Herrero, M. Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.). Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).
- Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), (2012).
- Faulkner, C., et al. An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants. Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).
- Kuhn, B. F. Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. "Stevnsbaer.". European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).
- Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
- Ruzin, S. E. . Plant microtechnique and microscopy. , (1999).
- Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system. Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).
- Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana). Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).
- Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering. Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).
- Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy – Physiological terminology and classification for dormancy research. HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).
- Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques. Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).
- Kaufmann, H., Blanke, M. Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry. Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).
- Herrero, M., Dickinson, H. G. Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses. Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).
