概要

Kombination von histochemische Färbung und Bildanalyse, Stärke in den Eierstock Primordia der Süßkirsche während der Winterruhe zu quantifizieren

Published: March 20, 2019
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概要

Wir präsentieren eine Methodik zur Quantifizierung des Stärkegehalts in den Eierstock Primordia in Süßkirsche (Prunus Avium L.) während der Winterruhe, mithilfe einer Bild-Analyse-System mit histochemische Techniken kombiniert.

Abstract

Veränderungen in Stärke in kleinen Strukturen sind verbunden mit wichtigen Ereignissen während mehreren Pflanze Entwicklungsprozesse, einschließlich der reproduktiven Phase von der Bestäubung zur Befruchtung und das Einsetzen der Fruchtkörper. Jedoch sind Abweichungen in der Stärke während der Blüte Differenzierung nicht vollständig, vor allem auf die Schwierigkeiten bei der Quantifizierung des Stärkegehalts in den besonders kleinen Strukturen der Blume Primordia bekannt. Hier beschreiben wir eine Methode zur Quantifizierung der Stärke in den Eierstock Primordia der Süßkirsche (Prunus Avium L.) mithilfe einer Bildanalysesystem angeschlossen an das Mikroskop, wodurch im Zusammenhang mit den Veränderungen im Stärkegehalt mit den verschiedenen Phasen der Vegetationsruhe vom Herbst bis zum Frühling. Zu diesem Zweck wird die Dormanz Blütenknospen Statusermittlung durch die Auswertung der Knospe Wachstum der Triebe, die zu verschiedenen Zeitpunkten in der Winterzeit in kontrollierten Bedingungen übertragen. Für die Quantifizierung der Stärke in den Eierstock Primordia Blütenknospen sind sequentiell gesammelt, fixiert, eingebettet in Paraffinwachs, geschnitten und gefärbt mit I2Kl (Kaliumjodid-Jod). Die Vorbereitungen sind unter dem Mikroskop beobachtet und analysiert, indem ein Bild-Analysator, der Stärke deutlich vom Hintergrund unterscheidet. Inhaltswerte Stärke erhält man durch Messung der optischen Dichte des Bildes, die die gefärbten Stärke entspricht, unter Berücksichtigung der sich aus der optischen Dichte der einzelnen Pixel als eine Schätzung des Stärkegehalts des Rahmens studierte.

Introduction

Gemäßigte waldige Stauden passen sich den Jahreszeiten durch die Modulation, ihr Wachstum und ihre Entwicklung. Während sie im Frühling und Sommer zu entwickeln, aufhören sie zu wachsen im Herbst, im Winter1schlafend gehen. Obwohl Dormanz bei niedrigen Temperaturen im Winter überleben kann, ist chillen Voraussetzung für eine ordnungsgemäße Knospenaustrieb im Frühjahr2. Die wichtigen Implikationen der Vegetationsruhe in gemäßigten Obstproduktion und Forstwirtschaft führten zu vielfältigen Bemühungen zu bestimmen und Vorhersage der Dormanz Periode3. In Obst-Baum-Spezies, empirischer Experimente Übertragung Triebe zu zwingen, Bedingungen und statistische Vorhersagen basierend auf Daten der Blüte sind aktuelle Ansätze feststellen, das Datum für das Brechen der Keimruhe, wodurch Forscher schätzen die Chillen Anforderungen für jede Sorte. So erkennen Sie die Dormanz Status basierend auf biologische Prozesse bleibt jedoch unklar3.

Blüte im gemäßigten Obstbäume wie Süßkirsche (Prunus Avium L.), tritt einmal im Jahr und dauert etwa zwei Wochen. Allerdings beginnen Blumen zu differenzieren und rund 10 Monate früher, während der vergangenen Sommer4zu entwickeln. Blume Primordia aufhören zu wachsen im Herbst ruhend innerhalb der Knospen im Winter zu bleiben. In dieser Zeit muss jeder Sorte eine besondere kühle Voraussetzung für richtige Blüte4ansammeln. Trotz des Fehlens der phänologischen Veränderungen in den Knospen im Winter Blume Primordia sind physiologisch aktiv während der Vegetationsruhe und die Anhäufung von kühlen Temperaturen wurde vor kurzem assoziiert mit der Dynamik der Stärke Anhäufung oder verringern innerhalb der Zellen von der Eierstock Primordium bietet einen neuen Ansatz für Dormanz Bestimmung5. Die geringe Größe und die Position des Eierstocks Primordium erfordern jedoch eine spezielle Methodik.

Stärke ist das große Speicher-Kohlenhydrat im Gehölz Arten6. So haben Veränderungen in Stärke auf die physiologische Aktivität der Blume Gewebe, die brauchen Kohlenhydrate zur Unterstützung ihrer Entwicklung7,8in Verbindung gebracht. Andere wichtige Ereignisse während der reproduktiven Prozesses beziehen sich auch auf Variationen in Stärkegehalt in verschiedenen floralen Strukturen, z. B. Anthere Meiose9, das Wachstum der Pollenschläuche durch den Stil oder Ovulum Befruchtung10. Histochemische Techniken ermöglichen die Erkennung von Stärke in jedem bestimmten Gewebe Blume Primordia während der Vegetationsruhe. Allerdings bleibt die Schwierigkeit bei der Quantifizierung dieser Stärke, im Anschluss an ihre Muster der Akkumulation/Abnahme über die Zeit oder die Stärke zu vergleichen zwischen Gewebe, Sorten oder Jahre Inhalte zulassen. Dies ist aufgrund der kleinen Menge an Gewebe für die analytische Techniken11zur Verfügung. Als Alternative ermöglicht Bildanalyse, Mikroskopie12 verbunden die Quantifizierung der Stärke in sehr kleine Proben von pflanzlichen Gewebe13.

Ansätze, die Kombination von Mikroskopie und Bildanalyse wurden zur quantifizieren des Inhalts der verschiedenen Komponenten in pflanzlichen Geweben, wie Kallose14, Mikroröhrchen15, oder16, durch Messung der Größe des Bereichs gefärbt durch spezifische Stärke Flecken. Für Stärke, kann leicht erkannt werden mit Kaliumiodid-Jod (ich2KI) Reaktion17. Diese Methode ist sehr spezifisch; Ich2KI Plasmamembrane innerhalb der laminaren Struktur der Stärke Körner und bildet eine dunkle blaue oder rötlich-braune Farbe, abhängig von der Amylosegehalt Stärke18. Abschnitte mit ich befleckt2KI Fleck zeigen ausreichenden Kontrast zwischen Stärke und dem Hintergrund Gewebe, so dass eine eindeutige Stärke-Erkennung und der anschließenden Quantifizierung durch die Bild-Analyse-System19. Obwohl dieser Farbstoff nicht stöchiometrischen ist, ist die Anhäufung von Jod proportional zur Länge des Stärke-Moleküls, die17stark variieren kann. So kann die Größe des verschmutzten Bereich ausgedrückt als die Anzahl der Pixel nicht genau den Inhalt der Stärke, da hohe Unterschiede im Stärkegehalt zwischen Feldern mit gefärbten Bereiche ähnlicher Größe gefunden werden konnte. Als Alternative kann der Stärkegehalt ausgewertet werden durch die Messung der optischen Dichte der gefärbten Körnchen auf schwarz / weiß Bilder von dem Mikroskop ausgewiesen in verschiedenen Geweben in Apricot8,13 , 19, Avocado10,20und Olive21.

Hier beschreiben wir eine Methodik, die die experimentelle Bestimmung der Dormanz Status mit der Quantifizierung der Stärkegehalt in Primordium Eierstockgewebe vom Herbst kombiniert bis zum Frühling in süßen Kirschen, bietet ein neues Tool für das Verständnis und die Vorhersage der Vegetationsruhe basierend auf der Studie der biologischen Mechanismen im Zusammenhang mit Keimruhe.

Protocol

(1) Dormanz Entschlossenheit und Pflanze Materialkollektion Probieren Sie die Blütenknospen im Feld. Dormanz Studien sind Langzeitexperimente und benötigen Erwachsene groß genug Bäume Knospen zu sammeln und schießt den ganzen Winter ohne die Bäume Entwicklung im nächsten Frühjahr. Spezielle Obstgarten Management könnte je nach dem Trainingssystem erforderlich; so kann Beschneidung weniger schwerwiegend als für Produktionszwecke Obst sein. Jede Woche von Anfang Herbst bis zum Beginn des austrei…

Representative Results

Dormanz Studien erfordern die Festlegung des Zeitpunkts, wann die abschreckenden Voraussetzungen erfüllt sind. Trotz des Fehlens der phänologischen Veränderungen während des Winters unter Feldbedingungen (Abbildung 1A) wiederherstellen Kirschbäume nicht die Kapazität des Wachstums unter geeigneten Bedingungen, bis sie einen bestimmten Zeitraum unter niedrigen Temperaturen passieren. Die regelmäßige Übertragung der Triebe zu einer kontrollierten Bedin…

Discussion

Dormanz in holzigen Stauden stellt deutliche Auswirkungen im Obstbau und Forstwirtschaft im Klimawandel, obwohl der biologische Prozess hinter Dormanz unklar bleibt. Dormanz Studien aus verschiedenen Blickwinkeln angegangen werden können, aber die Forschung auf der Suche nach einer biologischen Marker für die Winterruhe hat in den letzten Jahren intensiviert. Allerdings wurden die meisten Versuche, eine eindeutige Kennzeichen, wenn eine Knospe Dormanz gebrochen hat zu finden erfolglos3. Die hier…

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren danken dankbar Maria Herrero und Eliseo Rivas für ihre hilfreiche Diskussion und Beratung. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Ministerio de Economía y Competitividad – europäischer Fonds für regionale Entwicklung, Europäische Union [Grant-Nummer BES-2010-037992, E. F.]; Das Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria [Grant-Nummern RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00, RTA2017-00003-00]; und des Gobierno de Aragón – Europäische Sozialfonds, Europäische Union [Grupo Consolidado A12-17R].

Materials

Precision scale Sartorius CP225D
Stereoscopic microscope Leica Microsystems MZ-16
Drying-stove Memmert U15
Paraffin Embedding station Leica Microsystems EG1140H
Rotatory microtome Reichert-Jung 1130/Biocut
Microtome blade Feather S35 Stainless steel
Bright field microscope Leica Microsystems DM2500
Digital Camera Leica Microsystems DC-300
Image Analysis System Leica Microsystems Quantiment Q550

参考文献

  1. Kurokura, T., Mimida, N., Battey, N. H., Hytönen, T. The regulation of seasonal flowering in the Rosaceae. Journal of Experimental Botany. 64 (14), 4131-4141 (2013).
  2. Rohde, A., Bhalerao, R. P. Plant dormancy in the perennial context. Trends in Plant Science. 12 (5), 217-223 (2007).
  3. Fadón, E., Rodrigo, J. Unveiling winter dormancy through empirical experiments. Environmental and Experimental Botany. 152, 28-36 (2018).
  4. Fadón, E., Rodrigo, J., Herrero, M. Is there a specific stage to rest? Morphological changes in flower primordia in relation to endodormancy in sweet cherry (Prunus avium L.). Trees – Structure and Function. , (2018).
  5. Fadón, E., Herrero, M., Rodrigo, J. Dormant flower buds actively accumulate starch over winter in sweet cherry. Frontiers in Plant Science. 9 (171), (2018).
  6. Loescher, W. H., Mccamant, T., Keller, J. D. Carbohydrate reserves, translocation and storage in woody plant roots. HortScience. 25 (3), 274-281 (1990).
  7. Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiology. , (2016).
  8. Rodrigo, J., Hormaza, J. I., Herrero, M. Ovary starch reserves and flower development in apricot (Prunus armeniaca). Physiologia Plantarum. 108 (1), 35-41 (2000).
  9. Julian, C., Rodrigo, J., Herrero, M. Stamen development and winter dormancy in apricot (Prunus armeniaca). Annals of Botany. 108 (4), 617-625 (2011).
  10. Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Pistil starch reserves at anthesis correlate with final flower fate in avocado (Persea americana). PLoS One. 8 (10), e78467 (2013).
  11. Smith, A. M., Zeeman, S. C. Quantification of starch in plant tissues. Nature Protocols. 1 (3), 1342-1345 (2006).
  12. Eliceiri, K. W., et al. Biological Imaging Software Tools. Nature Methods. 9 (7), (2013).
  13. Rodrigo, J., Herrero, M. Influence of intraovular reserves on ovule fate in apricot (Prunus armeniaca L.). Sexual Plant Reproduction. 11, 86-93 (1998).
  14. Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: A novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), (2012).
  15. Faulkner, C., et al. An automated quantitative image analysis tool for the identification of microtubule patterns in plants. Traffic. 18 (10), 683-693 (2017).
  16. Kuhn, B. F. Determination of starch in ovules of the sour cherry cv. "Stevnsbaer.&#34. European Journal of Horticultural Science. 71 (3), 120-124 (2006).
  17. Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
  18. Ruzin, S. E. . Plant microtechnique and microscopy. , (1999).
  19. Rodrigo, J., Rivas, E., Herrero, M. Starch determination in plant tissues using a computerized image analysis system. Physiologia Plantarum. 99 (1), 105-110 (1997).
  20. Alcaraz, M. L., Hormaza, J. I., Rodrigo, J. Ovary starch reserves and pistil development in avocado (Persea americana). Physiologia Plantarum. 140 (4), 395-404 (2010).
  21. Suarez, C., Castro, A. J., Rapoport, H. F., Rodriguez-García, M. I. Morphological, histological and ultrastructural changes in the olive pistil during flowering. Sexual Plant Reproduction. 25, 133-146 (2012).
  22. Lang, G. A., Early, J. D., Martin, G. C., Darnell, R. L. Endodormancy, paradormancy, and ecodormancy – Physiological terminology and classification for dormancy research. HortScience. 22 (3), 371-377 (1987).
  23. Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount clearing and staining of arabidopsis flower organs and siliques. Journal of Visualized Experiments. 2018 (134), 1-10 (2018).
  24. Kaufmann, H., Blanke, M. Changes in carbohydrate levels and relative water content (RWC) to distinguish dormancy phases in sweet cherry. Journal of Plant Physiology. 218 (July), 1-5 (2017).
  25. Herrero, M., Dickinson, H. G. Pollen-pistil incompatibility in Petunia hybrida: changes in the pistil following compatible and incompatible intraspecific crosses. Journal of Cell Science. 36, 1-18 (1979).
  26. Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), R100 (2006).

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記事を引用
Fadon, E., Rodrigo, J. Combining Histochemical Staining and Image Analysis to Quantify Starch in the Ovary Primordia of Sweet Cherry during Winter Dormancy. J. Vis. Exp. (145), e58524, doi:10.3791/58524 (2019).

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