Presenteren we een methodologie om te kwantificeren van het zetmeelgehalte in de eierstok primordia in zoete kers (Prunus avium L.) tijdens de winter-rustperiode met behulp van een systeem voor de analyse van afbeelding is gecombineerd met histochemische technieken.
Veranderingen in zetmeel in kleine structuren zijn gekoppeld aan belangrijke gebeurtenissen tijdens verschillende plant ontwikkelings processen, waaronder de reproductieve fase van bestuiving tot bevruchting en het begin van de vruchtzetting. Echter variaties in zetmeel tijdens bloem differentiatie niet volledig bekend zijn, voornamelijk als gevolg van de moeilijkheid van het zetmeelgehalte in de met name kleine structuren van de bloem primordia kwantificeren. Hier beschrijven we een methode voor de kwantificering van zetmeel in de eierstok primordia van zoete kers (Prunus avium L.) met behulp van een systeem voor de analyse van afbeelding is gekoppeld aan de Microscoop, waarmee de betreffende de wijzigingen in de inhoud van de zetmeel met de verschillende fasen van ruststadia van herfst naar het voorjaar. Voor dit doel, wordt de status van de rustperiode van bloemknoppen bepaald door de evaluatie van de groei van de kiem van scheuten overgedragen aan gecontroleerde omstandigheden op verschillende momenten in de winter. Voor de kwantificering van zetmeel in de eierstok primordia, bloemknoppen zijn sequentieel verzameld, vaste, ingebed in paraffine, gesegmenteerd en gekleurd met I2Kl (kalium jodide-jodium). Preparaten worden waargenomen onder de Microscoop en geanalyseerd door een afbeelding-analyzer die duidelijk zetmeel van de achtergrond onderscheidt. Zetmeel inhoud waarden worden verkregen door het meten van de extinctie van de afbeelding die correspondeert met de gekleurde zetmeel, gelet op de som van de extinctie van elke pixel als een schatting van het zetmeelgehalte van het frame studeerde.
Gematigde houtachtige planten aan te passen aan de seizoenen door modulerende hun groei en ontwikkeling. Terwijl ze tijdens de lente en de zomer ontwikkelen, stoppen ze met groeien in het najaar te gaan slapend in winter1. Hoewel ruststadia hen in staat stelt om te overleven bij lage wintertemperaturen, is koelen een voorwaarde voor een goede budburst in voorjaar2. De belangrijke implicaties rustperiode in gematigde fruitteelt- en bosbouw van hebben geleid tot diverse inspanningen om te bepalen en te voorspellen de rustperiode periode3. In boom fruitsoorten, empirische experimenten overdracht van scheuten aan het dwingen van voorwaarden en statistische voorspellingen op basis van gegevens van de bloei zijn huidige benaderingen om te bepalen van de datum van het breken rustperiode, waarmee onderzoekers te schatten van de koeling eisen voor elke cultivar. Het bepalen van de status van de rustperiode op basis van biologische processen blijft echter onduidelijk3.
Bloei in gematigde fruitbomen, zoals zoete kers (Prunus avium L.), gebeurt eenmaal per jaar en duurt ongeveer twee weken. Echter beginnen bloemen te differentiëren en ontwikkelen van ongeveer 10 maanden eerder, tijdens de vorige zomer4. Bloem primordia stoppen met groeien in het najaar te blijven slapende binnen de knoppen in de winter. In deze periode moet elke cultivar accumuleren een bepaalde koelen vereiste voor goede bloei4. Ondanks het ontbreken van fenologische veranderingen in de knoppen in de winter, bloem primordia fysiologisch actief zijn tijdens de rustperiode en de accumulatie van koelen temperaturen heeft onlangs in verband gebracht met de dynamiek van de accumulatie van zetmeel of verkleinen binnen de cellen van de eierstok primordium, biedt een nieuwe aanpak voor ruststadia bepaling5. Echter, de geringe omvang en de locatie van de eierstok primordium vereisen een speciale methodologie.
Zetmeel is de grote opslag koolhydraat in houtige plant soorten6. Dus, veranderingen in zetmeel verband met de fysiologische activiteit van de weefsels van de bloem, die koolhydraten moeten ter ondersteuning van hun ontwikkeling7,8. Verschillende belangrijke gebeurtenissen tijdens het reproductieve proces zijn ook gerelateerd aan variaties in zetmeelgehalte in verschillende bloemen structuren, zoals helmknop meiose9, de groei van de stuifmeel-buizen door middel van de stijl of zaadknop bevruchting10. Histochemische technieken zorgen ervoor dat het zetmeel in elke specifieke weefsel van de bloem primordia tijdens de rustperiode. Het probleem blijft echter in het kwantificeren van dat zetmeel om na haar patroon van accumulatie/daling in tijd of in het zetmeel vergelijken inhoud onder weefsels, cultivars of jaren. Dit is te wijten aan de kleine hoeveelheid weefsel beschikbaar voor de analytische technieken11. Als alternatief kan beeldanalyse gekoppeld aan microscopie12 de kwantificering van het zetmeel in zeer kleine steekproeven van plant weefsel13.
Benaderingen combineren microscopie en beeld analyse zijn gebruikt voor het kwantificeren van de inhoud van verschillende onderdelen in plantaardige weefsels, zoals de callose14, slangen15, of16, door het meten van de grootte van het gebied geverfd door specifieke zetmeel vlekken. Voor zetmeel, dit kan worden gemakkelijk gedetecteerd met behulp van de kaliumjodide-jodium (ik2KI) reactie17. Deze methode is zeer specifiek; Ik2KI intercalates binnen de laminaire structuur van zetmeel korrels en vormt een donker blauwe of roodbruine kleur, afhankelijk van de inhoud van de amylose van de zetmeel-18. Secties gekleurd met I2KI vlek Toon voldoende contrast tussen zetmeel en het weefsel van de achtergrond, waardoor de detectie van een ondubbelzinnige zetmeel en de daaropvolgende kwantificering door de afbeelding analyse systeem19. Hoewel deze kleurstof niet stoichiometrische is, is de accumulatie van jodium evenredig aan de lengte van het zetmeel-molecuul, die sterk van17 variëren kan. Dus, de grootte van de gebrandschilderde gebied, uitgedrukt als het aantal pixels kan niet weerspiegelen nauwkeurig de inhoud van zetmeel, aangezien hoge verschillen in zetmeelgehalte kon worden gevonden tussen velden met gekleurde gebieden van vergelijkbare grootte. Als alternatief kan het zetmeelgehalte worden geëvalueerd door het meten van de extinctie van de gekleurde korrels op zwart-witafbeeldingen verkregen van de Microscoop, zoals het is gemeld in verschillende weefsels in abrikoos8,13 , 19, avocado10,20, en olijf21.
Hier beschrijven we een methodologie die de experimentele bepaling van de status van de rustperiode met de kwantificering van zetmeelgehalte in de eierstok primordium weefsel van herfst combineert naar het voorjaar in zoete kers, het aanbieden van een nieuwe tool voor het begrip en de voorspelling rustperiode op basis van de studie van de biologische mechanismen van gekoppeld rustperiode.
Rustperiode in houtachtige planten presenteert duidelijke gevolgen in fruitteelt- en bosbouw in een veranderend klimaat, hoewel het biologische proces achter ruststadia onduidelijk blijft. Ruststadia studies kunnen vanuit verschillende gezichtspunten worden benaderd, maar het onderzoek op zoek naar een biologische marker voor de winter-rustperiode is toegenomen de laatste jaren. Echter, zijn de meeste pogingen om te vinden een duidelijke indicator weergeven wanneer een knop ruststadia heeft gebroken mislukte<sup class="x…
The authors have nothing to disclose.
De auteurs worden Maria Herrero en Eliseo Rivas dankbaar bedanken voor hun nuttige discussie en advies. Dit werk werd gesteund door het Ministerio de Economía y Competitividad — Europees Fonds voor regionale ontwikkeling, Europese Unie [subsidie nummer BES-2010-037992 tot E. F.]; het Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria [subsidie nummers RFP2015-00015-00, RTA2014-00085-00-, RTA2017-00003-00]; en de Gobierno de Aragón — Europees Sociaal Fonds, de Europese Unie [Grupo Consolidado A12-17R].
Precision scale | Sartorius | CP225D | |
Stereoscopic microscope | Leica Microsystems | MZ-16 | |
Drying-stove | Memmert | U15 | |
Paraffin Embedding station | Leica Microsystems | EG1140H | |
Rotatory microtome | Reichert-Jung | 1130/Biocut | |
Microtome blade | Feather | S35 | Stainless steel |
Bright field microscope | Leica Microsystems | DM2500 | |
Digital Camera | Leica Microsystems | DC-300 | |
Image Analysis System | Leica Microsystems | Quantiment Q550 |