概要

Visualizzazione della migrazione cellulare tangenziale nel Tectum ottica di pulcino in via di sviluppo

Published: October 24, 2018
doi:

概要

Descriviamo i metodi per l’etichettatura fluorescente di tangenzialmente migrazione cellule mediante elettroporazione e per l’imaging di time-lapse del movimento cellulare con etichetta in una cultura di piatto-Monte al fine di visualizzare la migrazione delle cellule comportamento nel tectum ottica di pulcino in via di sviluppo .

Abstract

Time-lapse imaging è un potente metodo per analizzare il comportamento di migrazione delle cellule. Dopo d’etichettatura delle cellule fluorescenti, il movimento delle cellule con etichettate nella cultura può essere registrato sotto video microscopia. Per l’analisi di migrazione delle cellule nel cervello in via di sviluppo, fetta di cultura è comunemente usato per osservare la migrazione cellulare parallela alla sezione fetta, come ad esempio la migrazione cellulare radiale. Tuttavia, limitati informazioni possono essere ottenute dal metodo di cultura slice per analizzare la migrazione cellulare perpendicolare alla sezione fetta, come ad esempio la migrazione cellulare tangenziale. Qui, presentiamo i protocolli per time-lapse di imaging per visualizzare la migrazione cellulare tangenziale nel tectum ottica di pulcino in via di sviluppo. Una combinazione di cella etichettatura da elettroporazione in ovo e una successiva cultura di piatto-Monte sull’inserto di cultura cellulare consente il rilevamento di movimento di migrazione cellulare nel piano orizzontale. Inoltre, il nostro metodo facilita il rilevamento del comportamento delle singole celle e l’azione collettiva di un gruppo di cellule a lungo termine. Questo metodo può essere applicato potenzialmente per rilevare la modifica sequenza della fluorescente-etichetta micro-struttura, compreso l’allungamento assonale nello spostamento dei tessuti o cellule neurale nel tessuto non neurali.

Introduction

Lo studio della migrazione cellulare è proseguito con la tecnica avanzata di imaging dal vivo. Dopo d’etichettatura delle cellule fluorescenti, l’andamento temporale delle cellule con etichettate in una piastra di coltura o in vivo può essere registrato sotto video microscopia. Nello studio dello sviluppo neurale, i cambiamenti morfologici della migrazione di cellule o allungando gli assoni sono stati analizzati usando la formazione immagine di time-lapse. Per l’imaging efficace, è indispensabile applicare un metodo adatto per la preparazione di etichettatura ed il tessuto delle cellule fluorescenti, basata allo scopo dell’esperimento e analisi. Per l’analisi di migrazione delle cellule nel cervello in via di sviluppo, fetta di cultura è stato comunemente utilizzato per osservare la migrazione cellulare parallela alla sezione fetta, come cellula radiale migrazione1,2,3. Il sistema di cultura fetta è usato anche per la rilevazione di cellule tangenziale migrazione4,5, ma non è adatto per analisi direzionale in casi dove le cellule disperdono perpendicolare alla sezione fetta.

Il tectum ottica è composta da una struttura multistrata, formata da migrazione di cellule radiali e tangenziali durante lo sviluppo embrionale. Formazione dello strato tectal dipende in primo luogo radiale migrazione delle cellule postmitotic precursori neuronali dalla zona ventricolare e destinazione finale negli strati correla con la loro data di nascita in zona ventricolare6. Per quanto riguarda la migrazione tangenziale, precedentemente abbiamo segnalato due flussi di migrazioni negli strati medio e superficiale in un tectum ottica di pulcino in via di sviluppo. Negli strati medio durante E6-E8, le cellule bipolari con un processo a lungo leader e un sottile processo finale migrano dorsalmente o ventralmente lungo il fasciculus assone di tectal assoni efferenti che eseguire dorso-ventralmente7. Dopo questa migrazione di axophilic, le cellule si differenziano in neuroni multipolari situati negli strati profondi. Negli strati superficiali durante E7-E14, le cellule migranti disperdono orizzontalmente riformando un processo leader ramificato e dispersione in più direzioni8. Dopo la dispersione di migrazione, le cellule di quest’ultime alla fine differenziano in neuroni superficiali delle varie morfologie. In entrambi i casi, una cultura di piatto-mount è efficiente per osservare il movimento delle cellule parallela alla superficie pial.

Qui, presentiamo un protocollo per time-lapse imaging per visualizzare migrazione tangenziale delle cellule in via di sviluppo pulcino tectum ottica7,8. Combinazione di cella etichettatura da elettroporazione in ovoe una successiva cultura di piatto-Monte sull’inserto di cultura cellulare consente di rilevamento della direzione di movimento e migrazione delle cellule la migrazione. L’obiettivo di questo metodo è quello di facilitare l’individuazione di sia il comportamento delle singole celle a lungo termine e l’azione collettiva di un gruppo di cellule nel piano orizzontale.

Protocol

1. Elettroporazione In Ovo Preparare il DNA del plasmide di espressione per l’etichettatura fluorescente in alta concentrazione. Isolare il DNA da 200 mL di coltura batterica con il metodo di lisi alcalina utilizza colonne di scambio anionico secondo il protocollo del produttore (Tabella materiali). Mix pCAGGS-EGFP e pCAGGS-mCherryNuc ad una concentrazione finale di 4 µ g / µ l ciascuna.Nota: Privo di endotossina di purificazione del DNA del plasmide può essere preferito per ele…

Representative Results

La figura 2 Mostra la migrazione tangenziale superficiale visualizzata in una cultura di piatto-Monte a un periodo di tempo (0, 9, 18, 27 h) dopo l’inizio della registrazione. Film 1 è un filmato time-lapse di 10 min-intervalli per un periodo di 28 h e 50 min. La cornice è selezionata per mettere a fuoco sulle cellule migrazione dall’angolo inferiore sinistro con etichetta del telaio allo spazio senza etichetta (<strong cla…

Discussion

Il protocollo descritto sopra è ottimizzato per il rilevamento di migrazione cellulare in strati superficiali6,8. È applicabile per la rilevazione di strato intermedio migrazione flussi (film 5)6,7, solo da spostando la tempistica dell’elettroporazione (5,5 a E4.5) e l’inizio della cultura e imaging (E7.0 a E6.0).

La procedura presentata è …

開示

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato supportato da JSP KAKENHI Grant numero 15K 06740 a Y.W.

Materials

Materials
NucleoBond Xtra Midi Plus EF MACHEREY-NAGEL 740422.5 endotoxin-free plasmid DNA purification kit
20 ml syringe TERUMO SS-20ESZ
18 gauge needle TERUMO NN-1838R
Fast Green Wako 061-00031
100x penicillin and streptomycin Gibco 15140-122
glass capillary tube Narishige G-1
cell culture insert Millipore Millicell CM-ORG
Laminin SIGMA L2020 coating of culture insert
poly-L-Lysine Peptide Institute 3075 coating of culture insert
glass bottom dish Matsunami D11130H
Opti-MEM Gibco 31985-070 culture medium
F12 Gibco 11765-054 culture medium
fetal bovine serum Gibco 12483 culture medium
chick serum Gibco 16110082 culture medium
10xHBSS Gibco 14065-056
microsurgical knife Surgical specialties cooperation 72-1501
Name Company Catalog Number コメント
Equipment
curved scissors AS ONE No.11
micropipette processor SUTTER INSTRUMENT P97/IVF
forceps-type electrode BEX LF646P3x3
pulse generator BEX CUY21EX electroporator
fluorescence stereoscopic microscope Leica MZ16F
inverted fluorescence microscope Olympus IX81
gas controller Tokken MIGM/OL-2
temperature controller Tokai Hit MI-IBC
laser confocal unit Olympus FV300

参考文献

  1. Marín, O., Rubenstein, J. L. R. Cell migration in the forebrain. Annual Reviews of Neuroscience. 26, 441-483 (2003).
  2. Nadarajah, B., Alifragis, P., Wong, R. O. L., Parnavelas, J. G. Neuronal migration in the developing cerebral cortex: Observations based on real-time imaging. Cerebral Cortex. 13, 607-611 (2003).
  3. Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. Journal of Neuroscience. 23, 9996-10001 (2003).
  4. Martini, F. J., et al. Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration. Development. 136, 41-50 (2009).
  5. Polleux, F., Whitford, K. L., Dijkhuizen, P. A., Vitalis, T., Ghosh, A. Control of cortical interneuron migration by neurotrophins and PI3-kinase signaling. Development. 129, 3147-3160 (2002).
  6. Watanabe, Y., Yaginuma, H. Tangential cell migration during layer formation of chick optic tectum. Development, Growth and Differentiation. 57, 539-543 (2015).
  7. Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. NRP1-mediated Sema3A signals coordinate laminar formation in the developing chick optic tectum. Development. 141, 3572-3582 (2014).
  8. Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Dispersing movement of neuronal tangential migration in superficial layers of the developing chick optic tectum. 発生生物学. 437, 131-139 (2018).
  9. Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. Journal of Morphology. 88, 49-92 (1951).
  10. Cordelières, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLOS One. 8, e81266 (2013).
  11. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9, 676-682 (2012).

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記事を引用
Watanabe, Y., Sakuma, C., Yaginuma, H. Visualization of Tangential Cell Migration in the Developing Chick Optic Tectum. J. Vis. Exp. (140), e58506, doi:10.3791/58506 (2018).

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