Produção em grande escala de RNAs recombinantes em um andaime Circular usando um sistema derivado de Viroid em Escherichia coli

Em contraste com DNA e proteínas, protocolos para fácil, eficiente e econômica de produção de grandes quantidades de RNA não são abundantes. No entanto, investigação e indústria demanda quantidade crescente destas biomoléculas para investigar suas propriedades biológicas únicas¹, ou para ser empregado em sofisticadas aplicações biotecnológicas, incluindo a sua utilização como altamente específico aptamers ², agentes terapêuticos³ou pesticidas seletivos⁴. In vitro a transcrição e síntese química são comumente usados em pesquisas para produzir RNA. No entanto, estes métodos implicam limitações importantes quando grandes quantidades de produtos são necessárias. A alternativa lógica é usar a maquinaria de transcrição endógeno das células vivas, seguido de um processo de purificação para separar os RNAs de interesse dos companheiros celulares. Na sequência desta estratégia, foram desenvolvidos métodos para produzir RNA recombinante em células bacterianas, tais como o laboratório-friendly Escherichia coli⁵ ou o marinho roxo fototróficas alfa-Proteobacteria Rhodovolum sulfidophilum ⁶. a maioria dos métodos para produzir RNA recombinante em bactérias dependem a expressão de um andaime nativo de RNA altamente estável, tais como um tRNA ou um rRNA, no qual o RNA de interesse é inserido⁷. Isso impõe a necessidade de liberar o RNA de interesse fora a molécula quimérico, se a presença de RNA extra é um problema para as aplicações a jusante de⁸. Outro conceito em biotecnologia de RNA de recombinação é a produção de complexos ribonucleoprotein recombinante que pode ser o produto desejado por si ou usado como uma estratégia de proteção para aumentar a estabilidade do RNA de interesse^{9, 10}. Da mesma forma, a produção de RNAs circulares também tem sido sugerida como uma estratégia para gerar mais estável produtos¹¹.

Recentemente desenvolvemos um novo método para produzir grandes quantidades de RNA recombinante em e. coli que participa em três dos conceitos acima: a inserção de RNA de interesse em um andaime de RNA circular altamente estável e a expressão co do RNA recombinante com uma proteína de interação provavelmente produzir um complexo de ribonucleoprotein estável que se acumula em quantidades notáveis em bacteriana células¹². Em contraste com a evolução do anterior, usamos um andaime de RNA completamente alheio a Escherichia coli, ou seja um viroid. Viroides são um tipo muito particular de agentes infecciosos de plantas superiores que são constituídas exclusivamente por um relativamente pequeno (246-401 nt) altamente emparelhado-base de RNA circular¹³. Curiosamente, viroides são não-codificantes RNAs e, sem a ajuda de suas próprias proteínas, eles são capazes de completar ciclos infecciosos complexos no hospedeiros infectados¹⁴. Esses ciclos incluem a replicação de RNA RNA-para nos núcleos ou cloroplastos, dependendo da família viroid —Pospiviroidae ou Avsunviroidae, respectivamente — movimento através da planta infectada e evasão da resposta defensiva do hospedeiro. Viroides devem ser classificados entre os RNAs mais estáveis na natureza, em consequência de ser um RNA circular nu e ter que sobreviver no ambiente hostil de células vegetais infectados. Esta propriedade pode fazer viroides particularmente apropriada como andaimes para estabilizar a recombinação RNA em abordagens biotecnológicas. Além disso, o novo método baseia-se na expressão co do cadafalso viroid com uma interação da planta. Viroides replicam através de um mecanismo de rolamento-círculo no qual host enzimas são recrutadas para catalisar as diferentes etapas do processo. Notadamente algumas viroides, mais especificamente aqueles que pertencem a família Avsunviroidae¹⁵, contêm ribozimas que também estão envolvidas na replicação. Dependendo da espécie de viroid, transcrição de viroid RNAs é mediada pelo host RNA polimerase II ou o cloroplástico nuclear codificado RNA polimerase (NEP). Processamento de Viroid RNA parece ser catalisada por um host tipo III RNase, embora em viroides com ribozimas oligoméricas RNA intermediários Self cleave durante a replicação. Finalmente, os resultante monômeros viroid são circularizou, dependendo da família viroid, pelo ligase do DNA de anfitrião 1 ou o isoform cloroplástico de tRNA ligase^16,17. Esta última enzima está envolvida na ligadura das formas monoméricas dos viroides da família Avsunviroidae, como berinjela viroid latente (ELVd)¹⁸.

No decorrer de um trabalho para analisar os requisitos de ELVd sequência e estruturais que determinam o reconhecimento pela berinjela (Solanum melongena L.) ligase do tRNA, montamos um sistema experimental baseado na expressão co de ambas as moléculas em e. coli ¹⁹. notamos que as transcrições de ELVd mais-que-unidade self cleave eficientemente em células de Escherichia coli através da martelo incorporado ribozimas e que eram os monómeros de viroid resultante com 5′-hidroxila e 2′, 3′-fosfodiéster termini eficientemente circularizou pelo co expressa berinjela ligase do tRNA. Ainda mais, o RNA circular viroid resultante alcançou uma inesperada alta concentração em Escherichia coli, superiores dos rRNAs endógena¹². Ausência de replicação intermediários indicou falta de ELVd de RNA RNA-para amplificação nestas células bacterianas. Curiosamente, inserção de RNAs heterólogos em uma posição específica da molécula viroid teve um efeito moderado na acumulação do circular viroid-derivado RNAs¹². Estas observações nos fez imaginar um método para produzir grandes quantidades de recombinante RNAs em bactérias. Neste método, os cDNAs correspondente as RNAs de interesse são inseridos no cDNA a ELVd e o RNA quimérico resultante é expressa em e. coli através de um forte promotor constitutivo. Para o sistema funcionar, e. coli devem ser transformados co com um plasmídeo para expressar a berinjela ligase do tRNA. A transcrição de mais-do que-unidade ELVd-derivado é processada pelas martelo incorporado ribozimas e os monómeros resultantes com o termini apropriado são reconhecidos e circularizou pelo co expressa ligase do tRNA. Deste modo, o RNA de interesse é inserido em um andaime circular muito estável, consistindo da molécula circular viroid. Este RNA recombinante quimérico é provavelmente mais estabilizado no interior das células de Escherichia coli , pela formação de um complexo através da interação com a ligase do tRNA do ribonucleoprotein. Usando este método (Veja o protocolo abaixo), RNA aptamers, gancho de cabelo RNAs e outros RNAs estruturadas facilmente produzidos em quantidades de dezenas de miligramas por litro de cultura de Escherichia coli em condições laboratoriais normais e purificados a homogeneidade tomando vantagem de circularidade¹².