エシェリヒア属大腸菌のウイロイド派生システムを使用して円形の足場に組換え Rna の大量生産

DNA やタンパク質と対照をなして、簡単、効率的でコスト効果の高い生産多量の RNA のためのプロトコルは豊富ではないです。ただし、彼らのユニークな生物学的特性の¹を調査するまたはで使用されるこれらの生体分子の量を増やす研究と産業の需要が特異性の高いアプタマーとして彼らの使用を含むバイオ テクノロジー アプリケーションを洗練された²、治療薬³、または選択的な殺虫剤⁴。生体外のトランスクリプションと化学合成の研究では、RNA を生成するが使用されます。ただし、これらのメソッドは、大量の製品が必要な場合の重要な制限を伴います。論理の代替は、細胞の仲間から関心の Rna を分離する精製プロセスに続いて、生きた細胞の内因性転写機械を使用することです。この戦略は、次の研究室向けなど、細菌の細胞における組換え Rna を生成する手法が開発されたエシェリヒア属大腸菌⁵または、海洋紫光合成アルファ-proteobacterium Rhodovolum sulfidophilum⁶。 細菌における遺伝子組換え RNA を生成するほとんどのメソッドはネイティブの非常に安定した RNA の足場の式に依存、tRNA または、rRNA、関心の RNA が、挿入⁷のようです。余分な RNA の存在が下位アプリケーション⁸の問題の場合、これはキメラ分子から関心の RNA の要否を課しています。組換え RNA バイオ テクノロジーのもう一つの概念は、製品自体がありますまたは関心^{9、RNA の安定性を高める保護戦略として使用する組換えリボ核蛋白質複合体の生産 10}。同様に、円形の Rna の生産より安定した製品¹¹を生成するための戦略として提案されています。

我々 は最近多量の上記の概念の 3 つに参加するエシェリヒア属大腸菌の組換え RNA を生成する新しい方法を開発した: 非常に安定した円形 RNA 足場への関心の RNA との共発現の挿入、遺伝子組換えの RNA 相互作用の蛋白質を持つ可能性が高い安定したリボ核蛋白質の複雑なを生成する細菌の顕著な量の蓄積は細胞¹²です。以前の開発と対照をなして完全にエシェリヒア属大腸菌、すなわちウイロイドに外国人、RNA 足場を使用しました。ウイロイドは非常に特定のタイプのみによって構成され、比較的小さい (246 401 nt) 高等植物の病原菌の円形の RNA の高いベース対¹³。興味深いことに、ウイロイドが非コード Rna と、独自のタンパク質からヘルプはありません、彼らが感染したホスト¹⁴で複雑な感染サイクルを完了することができます。これらのサイクルは、核や葉緑体、ウイロイド家族によって RNA を複製-PospiviroidaeまたはAvsunviroidae、それぞれ、感染した植物と宿主の防御的な応答の回避運動。ウイロイドは裸円形 RNA、感染植物細胞の敵対的な環境で生き残るために持っていることの結果として、本質的に最も安定した Rna にランクする必要があります。このプロパティは、バイオ テクノロジーの手法で組換え RNA を安定させるために足場として特に適してウイロイドをすることができます。さらに、新しいメソッドは、相互作用の植物蛋白質を持つウイロイド足場の共発現に基づいています。ウイロイドは、ホスト プロセスの別のステップを触媒する酵素を募集してローリング サークル メカニズムを介して複製されます。特にいくつかウイロイド、具体的に家族のAvsunviroidae¹⁵に属するものには、リボザイムもレプリケーションに関与しているが含まれています。ウイロイド種に応じてウイロイド Rna の転写は RNA ポリメラーゼ II のホストまたはクロロプ ラストのエンコードされた核 RNA ポリメラーゼ (NEP) によって媒介されます。ウイロイド処理ホストにより触媒されると思われる III 型 RNase オリゴマーの RNA をリボザイムとウイロイドの中間体は自己複製中に切断が。最後に、結果のウイロイド モノマーが円形、ウイロイド家族によってホスト DNA リガーゼ 1 または tRNA のリガーゼ^16,17のクロロプ ラストのアイソ フォームで。この最後の酵素は、ナスの潜在ウイロイド(ELVd)¹⁸などの家族Avsunviroidaeウイロイドの単量体の形態の結紮に関与しています。

ナス (ナスl.) によって認識を決定する ELVd のシーケンスと構造的要件を分析する作業の過程で tRNA のリガーゼ、エシェリヒア属大腸菌の両方の分子の共発現に基づく実験システムを設定¹⁹. 単位よりも長い ELVd 成績証明書は、自己効率的に埋め込まれたハンマー ヘッド型リボザイムによるエシェリヒア属大腸菌のセルでクリーブ、結果ウイロイドの単量体 5′-水酸基と 2’、3′-リン酸ジエステル テルミニいた私たちは気づいた共発現ナス tRNA のリガーゼによって効率的に円形。さらに、生じる円形ウイロイド RNA は、内因性 Rrna¹²を越えるエシェリヒア属大腸菌、予期しない高濃度に達した。複製中間体の不在では、これらの細菌細胞の ELVd RNA を増幅の欠如が示されます。興味深いことに、ウイロイド分子の特定の位置における異種 Rna の挿入は、円形のウイロイド由来 Rna¹²の蓄積でそれなりの効果を持っていた。これらの観測では、大量の組換え細菌における Rna を生成する方法を想像できた。この方法で ELVd cDNA に関心の Rna に対応する Cdna が挿入されます、結果の想像上の RNA は強力な構成のプロモーターを介して, 大腸菌で発現します。動作するようにシステムの大腸菌はナスの tRNA のリガーゼを表現するプラスミッドの共同変換しなければなりません。ELVd 派生ユニットよりも長くトラン スクリプトが埋め込まれたハンマー ヘッド型リボザイムによって処理され、適切なテルミニを結果として得られるモノマーを認識し、共発現の tRNA のリガーゼによって円形します。このように、関心の RNA はウイロイド円形分子から成る非常に安定した円形の足場に挿入されます。この組換え想像上の RNA はおそらく更にエシェリヒア属大腸菌の細胞内のリボ核蛋白質 tRNA のリガーゼとの相互作用を介して複雑な形成による安定化します。このメソッドを使用して (以下のプロトコルを見なさい)、RNA アプタマー、ヘアピン Rna とその他の構造化された Rna 簡単に万人通常の実験室の条件で大腸菌文化の 1 リットルあたりミリグラムの量で生産され撮影の同質性に浄化されました。真円度¹²の利点。