Оценка клеточного стресса и воспаления в дискретных окситоцина секретирующих ядрах головного мозга новорожденных крыс до и после первого кормления молозивом

В отличие от нашего понимания раннего развития мозга, происходят в течение дней до недели после родов, относительно мало известно о множества динамических изменений, происходящих в первые часы жизни крыс. Ключевой задачей был небольшой размер мозга новорожденных крыс и требование для высокотехнологичных инструментов изолировать дискретные мозга или одиночных клеток. Исследования часто оценки гена транскрипции и трансляции не^1,2, который не дает твердое понимание функциональных уровней активированного сигнальных молекул. Другие рассмотреть выражение с использованием иммуногистохимия регионов мозга ссылку, которая не позволяет для количественной оценки выражения уровня³. Никаких исследований на сегодняшний день изучило активации сигнальные пути, связанные с крыс первого молозива, кормить в дискретных мозга, которая требует быстрой изоляции и жертву и измерение выражения протеина и фосфорилирование белков с помощью Западной blotting. В то время как мозг microdissection выполняется на старых и больших мозги, мы не выявили ссылку, выполняя одну ячейку мозга удар в мозге P0. Этот документ представляет собой протокол для изоляции ограниченных регионах неонатальной мозга, используя сравнительно низкотехнологичных удар техники и западных blotting процедура для измерения выражение протеина в относительно малых выборок. Этот протокол может быть подходящим для исследования вопросов, которые требуют оценки выражения протеина и столб-поступательные изменения (например., фосфорилирование) в относительно ограниченных районах небольших мозги любых видов, при условии, что пользователь может визуально определить области мозга, представляющих интерес с атласом и идентифицировать достопримечательности.

Этот метод был разработан для понимания изменений, происходящих в головном мозге в результате первого молозива новорожденных крыс корма, который богат окситоцина (OT). OT давно известны своей способностью стимулировать сокращения матки и пусть вниз молоко. Однако OT теперь известно играть широкий спектр ролей в регуляции многих телесных функций и поведения⁴. К примеру OT выступает против стресса и воспаления в сочетании с адаптивной афиллиативной поведения⁵, задержки опорожнения желудка и замедляет кишечного транзита. OT рецепторов (OTR) были определены в кишечных нейронов и кишечного эпителия^6,,78. Желудочно-кишечного тракта OT особенно важны для младенца в начале послеродового периода. К примеру грудное вскармливание ассоциируется с доставкой значительного количества OT новорожденных кишки^9,10, и данные показывают, что OTR сильно оверэкспрессировали в двенадцатиперстной кишки ворсинки в молоко, молочный период⁸.

В vitro эксперименты с использованием линии клеток кишки продемонстрировали на клеточном уровне, что окситоцин модулирует важных молекул в стресс, сигнальный путь^11,12 и играет регулирующую роль в переводе белков ¹². Эти исследования показывают, что компоненты молока, включая экзогенных окситоцина от матери, имеют важное значение в ответ развернул белка у новорожденных для снижения клеточного стресса¹³.

В естественных условиях и ex vivo исследования показали, что молозиво OT модулирует клеточного стресса ответ, воспаления и autophagy маркеров в Вилли кишечника новорожденных крыс. Новорожденного enterocytes страдают существенной клеточного стресса на их стороне Люминал, когда кишечник одновременно подвергается микробиоты от матери в многочисленных белков, включая гормонов, таких как OT⁹ и молозиво^{14,15 , 10 , 16}.

Эффекты OT на мозг были изучены¹⁷. Однако OT сигнальных механизмов, продемонстрировал в кишечнике в начале послеродового периода не были изучены в головном мозге. В этом документе метод для изоляции дискретных мозга ядер ствола мозга новорожденных крыс и гипоталамус, с помощью электрофореза используется для профилирования изолированных мозга. Общая цель этого метода является захватить состояние ячейки сигнализации в областях как можно ближе к рождения, до и после первого молочный поросенок, в ткани мозга с наименьшим индексом глиальных/нейронов мозга. Основанием для развития этой техники является, что она позволяет для быстрого изоляции регионов ограничены, микроскопические мозга новорожденных щенков с коллекцией более однородных нейронов для ex vivo исследований с использованием автоматизированных Западный blotting методология, предлагая весьма последовательной результаты на сравнительно небольшие образцы расчлененный. Недостатком предыдущие работы включает в себя более грубых диссекции (срезы мозга или весь мозг) и старых животных^18,19. Мозги молодых детенышей невероятно динамичны, показывая волны глиальных дифференциации после рождения. С целью изучения мозга изменения под влиянием первого кормления щенков, необходимо изучение ограниченного нейрональных ядер с воспроизводимые рассечение.

Молочные корма обычно анализируется иммунологических и питательного воздействия на здоровье или ген выражение (например, в enterocytes^20,21), тогда как редко рассматривается его влияние на областях мозга во время развития мозга. Со ссылкой на кишечнике холецистокинина рецепторов вагусной реле ядрах ствола головного мозга, но не внутриклеточных сигнальных путей²²был проанализирован эффект молока транзита в кишечнике на функции мозга. Существует обширная литература на уязвимость развивающегося мозга новорожденных недоедания матерей во время беременности²³, но стресс и воспаление сигналы не рассматриваются. Важно отметить, что текущий метод использует явление в день ноль крыса новорожденных, которая изолирует кровь родился молозиво раздражителей с вагусной реле висцеральных раздражителей. Это так называемые стресс гипо оперативность период характеризуется незрелых ядре tractus solitarius (НТС)-гипоталамический цепи сразу же после рождения^24,25 , ограничивающий НТС, паравентрикулярного ядра (ПВН), и supraoptic ядро (сын) сигналы на крови родился стимулы.

Этот метод полезен для анализа нескольких сигнальных путей и относительно ограничена нейрональных клеток, при том условии, что ткани мозга собирают в послеродовой день-0 в крыс, помимо ли матерей были оспорены или нет, любой вид лечения во время беременности. Помета могут быть проанализированы для эффектов молозиво, кормить против предварительно питание сигнализации. При сравнении сигналов между областями мозга с бедными по сравнению с богатые белком урожайности, этот метод позволяет в капиллярной определение общего белка полипептид полос в капиллярах, параллельно иммунной количественный белков антигенов. Этот метод позволяет количественные сравнения, используя условные единицы, результаты, полученные путем же антитела без стандартных количественных кривых и ссылка на общий белок в капиллярной. Сравнение результатов, полученных различными антителами возможно только с помощью количественных стандартных кривых.

Этот метод позволил для оценки двунаправленный сигнализации, происходящих между кишечника и мозга, что может повлиять на функции в обоих органов²⁶. Ассоциация между окситоцина и приема пищи, которая была подробно изучена в последние годы²⁷, поддерживает связь между повышенной окситоцина сигнализации и наличия питательных веществ. Эти исследования также поддерживают концепцию Конверс эту энергию, которую дефицита связаны с сокращением гипоталамуса окситоцина сигнализации.

Более ранние исследования эффекта OT на активность мозга продемонстрировал, что воспаление индуцированных кишки вызвало cFos транскрипции в гипоталамо НДС, миндалевидного и грушевидной коры, которая была огнеупорной ваготомия²⁸. Однако системных притока OT с секретин сократилась cFos реакции мозга на спровоцировали воспалительной реакции в кишечнике²⁸. Это предполагает, что влияние экзогенных OT было осуществлено маршруты помимо блуждающего реле, возможно через кровь сигнальных молекул, через площадь postrema^6,29.

В этом исследовании были оценены клеточного стресса сигнальных путей, которые ранее наблюдали в кишечнике в головном мозге. Гипотеза, что компоненты молока может защищать или отложить влияние воспаления на кишечнике проницаемость для микробиологических и других метаболитов, и в свою очередь, воздействие на мозг функция. Четко антагонистические различия в IkB против BiP сигнализации по направлению ворсинки, до и после грунтования молозиво¹³, предложил, что мозги новорожденных, все еще в процессе разработки, может смысле эти сигналы молозиво индуцированной кишки.

Сигнализации белка маркеры, используемые в предыдущих экспериментах кишки, которые связаны с эндоплазматического ретикулума стресса были измерены. Они включают ER шаперонов BiP, eIF2a фактор инициации перевода (которая служит интегратор стресс в ответ³⁰), eIF2a киназы p-PKR и два воспаления сигнализации белков (NF-kB и его ингибитора, IkB).

Были выбраны шесть областей мозга, основанные на их способности в взрослых выделяют или реагировать ОП. НТС, расположен в верхней продолговатого мозга, первое реле висцеральных ввода и получает прямой передачи сигналов от блуждающего сенсорных нейронов в кишечнике³¹ возможно родился крови цитокинов, токсинов и гормоны через прилегающие области postrema³². PVN, supraoptic ядро (сын), стриатума ядер (STR), коре (CX) и медиальный preoptic ядро (МПО) получают сигналы от кишки через НТС.

Результаты показали, что реакции клеточного стресса в непосредственной послеродовой период до молозиво грунтовки и сразу же после первого кормления отличается в НТС, по сравнению с PVN и сына. Сигнализации в CX, STR и MPO отличается от НДС и сына, а также. Различные защитные функции OT было показано ранее для модуляции клетки стресс и воспалительного процесса в кишечнике скорее всего воспринимается некоторых областей головного мозга. В совокупности данные указывают, что на клеточном уровне, в течение первых часов после рождения, мозг реагирует на метаболический стресс, связанный с недостаточностью питательных веществ. Данные также показывают, что масштабы и направления регулирования последствий кормить молозивом зависят от региона и что в некоторых регионах они зеркало OT эффекты, приведенный ранее в кишечнике.