절연 및 전체 돼지 췌 장 Decellularization

돼지 췌 장 및 여기에 제시 된 decellularization 절차의 해 부 고 덴 부르 크 대학교의 윤리 지침을 따르십시오. 1입니다. Decellularization 설정의 준비 Peristalic 펌프 세제 입구 컨테이너 시리즈에 연결 하 고 다음 기관에 췌를 통해 는 degasser 챔버 3 x 5 m m 실리콘 튜브를 사용 하 여 ( 그림 1참조). 기관 실에서 튜브의 무료 끝에 남성 루어를 연결 합니다. 다른 3 x 5 m m 실리콘 튜브를 사용 하 여 연결할 기관 챔버는 세제 콘센트 컨테이너를 통해 perfused 세제를 수집 하는 연동 펌프. 2 ml 레이블이 없는 피 펫 세제 입구 컨테이너와 세제 콘센트 cointainer에서 튜브의 무료 끝에 연결 합니다. 4 ° c.에서 전체 설정 유지 그림 1: 관류 설정 준비. 설정에 표시 된 대로 3 x 5 m m 실리콘 튜브를 사용 하 여, 시리즈에서 세제 유입 컨테이너에 연결 연동 펌프는 degasser, 기관 실. 검은 화살표 기관 실로 세제 입구 컨테이너에서 흐름 방향을 표시합니다. 세제 콘센트에 대 한 또 다른 3 x 5 m m 실리콘 튜브를 사용 하 고 세제 콘센트 컨테이너에는 기관 실 통해 연동 펌프 연결. 빨간색 화살표 세제 콘센트 컨테이너에 기관 실에서 흐름 방향을 표시합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오. 2입니다. Decellularization 솔루션의 준비 해결 방법 1 (인산 염 버퍼 염 [PBS]): 염화 나트륨 (137 밀리미터)의 8 g, 0.2 g 염화 칼륨 (2.7 m m)의 (10mm) 나트륨 인산 염, 1.44 g 및 0.24 g (1.8 m m) 칼륨 인산 염의 초순 물 1 L에 추가 하 고 해산 때까지 휘저어. 7.4 염 산 (HCl)에 pH를 조정 합니다. 전체 있음,이 솔루션의 3.2 L가 필요 합니다. 해결 방법 2 (PBS + 헤 파 린): 1 L의 솔루션 1, 헤 파 린 (17 국제 단위 [IU] /mL) 3.4 mL을 추가. 이 솔루션 신선한 준비 하 고 감기 될 때까지 얼음에 그것을 유지. 전체 있음,이 솔루션의 1.2 L가 필요 합니다. 해결 방법 3 (초순 나트륨 아 지 드 + disodium ethylenediaminetetraacetic 산 [EDTA]): 1 L의 초순, 1.86 g (5mm) EDTA와 200mg (0.02%) 나트륨 아 지 드의 추가. 소금은 녹아 때까지 휘저어. 멋진 솔루션을 사용 하기 전에 4 ° C. 전체 있음,이 솔루션의 22 L가 필요 합니다. 해결 방법 4 (PBS 나트륨 아 지 드 + EDTA): 1 L의 솔루션 1, 200 밀리 그램 (0.02%) 나트륨 아 지 드와 1.86 g (5mm) EDTA의 추가. 소금은 녹아 때까지 휘저어. 멋진 솔루션을 사용 하기 전에 4 ° C. 전체 있음,이 솔루션의 1 리터는 필요 합니다. 해결 방법 5 (초순 + 나트륨 아 지 드): 1 L의 초순, 추가 (0.02%) 나트륨 아 지 드의 200 밀리 그램. 소금은 녹아 때까지 휘저어. 멋진 솔루션을 사용 하기 전에 4 ° C. 전체 있음,이 솔루션의 260 L가 필요 합니다.참고: EDTA SDC와 침전을 형성 하 고 이후 SDC 처리 전후 즉시 세척을 위해 사용 될 것입니다 솔루션 5에서 제외 됐다. 해결 방법 6 (SDC + 트라이 톤 X-100): 초순의 940 mL을 추가 (4%)의 40 g SDC, 60 mL (6%) 트라이 톤 X-100, 200 밀리 그램 (0.02%) 나트륨 아 지 드의 고 (0.4 m m) phenylmethylsulfonyl 불 소 (PMSF)의 69.6 mg. 해산 때까지 휘저어. 멋진 솔루션을 사용 하기 전에 4 ° C. 사용 전에 PMSF를 추가 합니다. 전체 있음,이 솔루션의 9.6 L가 필요 합니다. 7 (DNase) 솔루션: 추가 10000 Kunitz 단위의 DNase-CaCl2 및 MgCl2(40 Kunitz 단위/mL) Dulbecco의 PBS의 250 mL에 나. 신선 하 게 준비 하 고 즉시 사용 합니다. 따뜻한 솔루션을 사용 하기 전에 37 ° C. 솔루션 8 (PBS + 나트륨 아 지 드): 1 L의 솔루션 1, 200mg (0.02%) 나트륨 아 지 드의 추가. 소금은 녹아 때까지 휘저어. 멋진 솔루션을 사용 하기 전에 4 ° C. 전체 있음,이 솔루션의 1 리터는 필요 합니다. 3입니다. 돼지 췌 장 해 부 참고:이 연구에서 돼지 췌 했다 해 부에서 안락사, heparinized (400 IU/kg) 여성 돼지는 농장에서 45 k g. 부정사 위치에 해 부 테이블에 돼지를 놓습니다. 중간 절 개를 xiphoidal 프로세스에서 치 골 (약 40cm)에 모든 복 부 장기를 노출 하는 메스를 사용 하 여 확인 합니다. 위치는 비장, 십이지 장, 및 연결 돌출부. 주요 십이지 장 시의 레벨을 찾아서 두 개의 별도 봉합을 사용 하 여 해당 사이트에서 구두로 십이지 장 선. 두 개의 별도 봉합 열 등 한 식도 선 그리고 위장을 꺼내가 위로 합자 사이. 소장에 도달 콜론에서 연결 조직 구분 합니다. 췌 장 비장 엽에 콜론의 결합 조직 구분 합니다. 동맥을 ligating 후 소장에서 콜론을 제거 합니다. 열 등 한 mesenteric 정 맥 및 열 등 한 mesenteric 동맥 나무를 찾아서 어디 췌의 caudally 표시 한 봉합 사로 선. 비장 동맥 선 하 고 hilum에서 비장을 가까이 한 봉합 함께 정 맥 distally 비장 제거를 위로 잘라. 십이지 장 및 연결 돌출부는 두 개의 별도 봉합 후에 십이지 장 선까지 십이지 장을 따릅니다. 해 부 포털 정 맥, 간에서 어떤 혈액 누출을 방지 하 여 합자 proximally 잘라 한 봉합으로 선. 문맥에서 decellularization 동안 콘센트로 제공합니다. 해 부 및 담 즙 덕트와 두 봉합 간 동맥 선. 봉합을 distally 컷. 신장 정 맥에서 대동맥을 찾아서 췌 장 영역에 도달할 때까지 근육과 결합 조직에서 두개골 방향에서 그것을 해 부. 뒤집어 췌 부드럽게 및 SMA와 CT를 그대로 유지 하는 대동맥 해 부와 대동맥 CT에 우수한 SMA를 열 등 한가 위를 잘라. 가 위로 조직을 둘러싼 나머지 잘라내어 췌를 꺼내. 4 m m arteriotomy 정에 연결 50 mL 주사기를 사용 하 여, 전체 기관 perfuses 때까지 또는 전체 기관 감기 될 때까지 솔루션 2 대동맥을 통해 장기를 플러시. 4. 돼지 췌 장 Decellularization에 대 한 준비 4 ° C에 또는 과정 전반에 걸쳐 얼음에 췌를 유지. 잘라가 위를 사용 하 여 십이지의 봉합, 초순 물 25 mL 피 펫을 사용 하 여 50-150 mL를 홍 조에 의해 식품의 그것을 청소 하 고 다시 봉합 선. 대동맥의 한쪽 끝 및 누설을 방지 하기 위해 봉합 SMA 및 CT 외 모든 분기를 선. 대동맥의 다른 쪽 끝에서 4 mm arteriotomy 정을 삽입 하 고 봉합 선. Decellularization 설치를 사용 하 여 20 mL/min에서 1 시간에 대 한 솔루션 3 췌 장 perfuse참고: 아무 거품 췌 입력 되도록 솔루션 3 펌프의 튜브를 프리 필. 장기의 모든 측면에서 어떤 누설에 대 한 모양과 봉합, 포털 정 맥 제외 하 고 열려 있는 모든 혈관 분 지 선. 솔루션 4에서-20 ° C에서 췌는 decellularization의 시작까지 동결. 5입니다. 돼지 췌 장 decellularization 4 ° c.에 췌 해 동 없음 기포 세제 입구 관에서 볼 수 있습니다 때까지 20 mL/min에서 솔루션 3 decellularization 설정에서 연동 펌프를 실행 합니다. Decellularization 컨테이너에서 췌를 놓고 췌의 대동맥에 세제 유입 튜브를 연결 합니다. 4 ° c.에 20 mL/min에서 하룻밤 솔루션 3 관류에 의해 장기를 씻어 기관 상공에 솔루션을 붓는 다. 솔루션 5 솔루션 3를 대체 하 고 4 ° c.에 20 mL/min에서 30 분 동안 췌 장 perfuse 기관 실에 솔루션을 붓는 다. 솔루션 6을 추가 하 고 perfuse 4 ° c.에 20 mL/min에서 8 h에 대 한 췌 장 기관 실에 솔루션을 붓는 다. 4 ° c.에 20 mL/min에서 96 h에 대 한 솔루션 5 관류에 의해 장기를 씻어 기관 실에 솔루션을 붓는 다. CaCl2 와 37 ° c.에 30 분 동안 MgCl2 를 포함 하는 Dulbecco의 PBS의 500 mL를 재순환 하 여 췌 DNase 치료에 대 한 준비 기관 실에 솔루션을 붓는 다. 솔루션 7의 250 mL을 추가 하 고 37 ° c.에 20 mL/min에서 4 h에 대 한 췌 장 perfuse 기관 실에 솔루션을 붓는 다. 4 ° c.에 20 mL/min에서 120 h에 대 한 솔루션 5 관류에 의해 장기를 씻어 짧은 기간에 4 ° C에서 또는 오랜 기간 동안-20 ° C에서 솔루션 8에서 장기를 저장 합니다. 6입니다. Decellularization의 확인 가 위를 사용 하 여, 3-10 mm biopsies 췌의 모든 돌출부에서 잘라내어 실 온에서 48 h에 대 한 포름알데히드에 그들을 수정. 15 분 초순에 조각을 세척 하 고 표준 프로토콜에 따라 조직 프로세서에서 처리 한 파라핀에 그들을 포함. 톰을 사용 하 여 5 µ m 섹션을 잘라내어 메이어의 hematoxylin 및 0.2% 알콜 오신 (그는) 표준 프로토콜을 다음에 의해 그들을 얼룩. 핵의 손실에 대 한 확인을 가벼운 현미경 슬라이드 보기참고: 동일한 방법으로 처리 신선한 조직에서 조각을 사용할 수 있습니다 제어로 핵의 존재에 대 한 확인.