分離と全体ブタ膵臓の Decellularization

ブタ膵臓とここで紹介する decellularization プロシージャの郭清ヨーテボリ大学の倫理的なガイドラインに従ってください。 1. Decellularization セットアップの準備 3 × 5 mm のシリコン チューブを使用して、peristalic ポンプ洗剤入口コンテナー シリーズの接続商工会議所、器官で膵臓にを介して脱ガス装置 (図 1参照)。男性のルアーをオルガン室管内の自由端に接続します。 洗剤アウトレット コンテナーを介して灌流の洗剤を収集する蠕動性ポンプ別 3 × 5 mm のシリコン チューブを使用して、接続機関室。 2 ml ラベル ピペットを管洗剤入口コンテナーと洗剤コンセント cointainer の空いている端点に接続します。 4 ° C で全体の設定を維持します。 図 1: 潅流セッティングの準備です。蠕動性ポンプ、脱ガス装置、機関室洗剤入口コンテナーをシリーズに接続する設定に示すように 3 × 5 mm のシリコン チューブを使用して。黒い矢印は、機関室に洗剤入口コンテナーからフローの方向を示します。洗剤のアウトレットの別の 3 × 5 mm のシリコン チューブを使用し、臓器商工会議所経由で蠕動性ポンプに接続洗剤アウトレット コンテナー。赤い矢印は、洗剤アウトレット コンテナーに機関室からの流れの方向を示します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 2. Decellularization 溶液の調製 解決策 1 (リン酸緩衝生理食塩水 [PBS]): 純水 1 L に塩化ナトリウム (137 の mM) の 8 g、塩化カリウム (2.7 mM) の 0.2 g、リン酸ナトリウム (10 mM) の 1.44 g と 0.24 g リン酸カリウム (1.8 mM) を追加し、溶けるまでかき混ぜます。塩酸 (HCl) 7.4 に pH を調整します。合計では、このソリューションの 3.2 L は必要です。 解決策 2 (PBS + ヘパリン): 1 L ソリューション 1 にヘパリン (17 [IU] の国際単位/mL) の 3.4 mL を追加。このソリューションの新鮮なを準備し、寒くなるまで氷の上にそれを維持します。合計では、このソリューションの 1.2 L が必要です。 解決策 3 (純水 + アジ化ナトリウム ナトリウム エチレンジアミン四酢酸 [EDTA]): 1 L の純水には 1.86 g (5 mM) EDTA とアジ化ナトリウム (0.02%) 200 mg を追加。塩が溶けるまでかき混ぜます。使用前に 4 ° C への解決策を冷やして下さい。合計では、このソリューションの 22 L は必要です。 ソリューション (PBS + アジ化ナトリウム EDTA) 4: 1 L ソリューション 1 に追加のアジ化ナトリウム (0.02%) および (5 mM) EDTA の 1.86 g 200 mg。塩が溶けるまでかき混ぜます。使用前に 4 ° C への解決策を冷やして下さい。合計では、このソリューションの 1 L が必要です。 解決策 (純水 + アジ化ナトリウム) 5: 1 L の純水に追加 (0.02%) アジ化ナトリウム 200 mg。塩が溶けるまでかき混ぜます。使用前に 4 ° C への解決策を冷やして下さい。合計では、このソリューションの 260 L が必要です。注: EDTA, SDC を沈殿物を形作るし、すぐ洗濯 SDC 治療前後のそれに使用されるので、ソリューション 5 から除かれました。 解決策 (SDC + トリトン X-100) 6: 純水の 940 Ml (4%) の 40 g を追加します。SDC (6%) 60 mLトリトン X-100, (0.02%) アジの 200 mg, (0.4 mM) 特異フッ化物 (PMSF) 69.6 mg。溶解するまで攪拌します。使用前に 4 ° C への解決策を冷やして下さい。PMSF を使用する前に追加します。合計では、このソリューションの 9.6 L が必要です。 解決策 7 (DNase): DNase の 10,000 Kunitz の追加ユニット-CaCl2と MgCl2を含む (40 Kunitz ユニット/mL) ダルベッコ PBS の 250 mL の私。新鮮な準備し、すぐに使用します。使用する前に 37 ° C に解決を暖めます。 解決策 8 (PBS + ナトリウム アジ化): 1 L ソリューション 1 に追加 (0.02%) アジ化ナトリウム 200 mg。塩が溶けるまでかき混ぜます。使用前に 4 ° C への解決策を冷やして下さい。合計では、このソリューションの 1 L が必要です。 3 ブタの膵臓の解剖 注: この研究では、ブタの膵臓切除したから安楽死、ヘパリン (400 IU/kg) 雌豚農場から 45 kg. 仰臥位で解剖テーブルに豚を配置します。 正中切開 xiphoidal プロセスから恥骨の骨 (約 40 cm) にメス、腹部臓器のすべてを公開することを確認します。 脾を探します、十二指腸、および接続耳たぶ。 大十二指腸乳頭のレベルを見つけ、2 つの独立した縫合糸を使用してそのサイトから口頭で十二指腸を結紮します。 2 つの独立した縫合糸で下の食道を縛るし、胃を取り出してハサミで合字の間をカットします。 大腸小腸に到達するから結合組織を分離します。 膵脾葉にアタッチするコロンの結合組織を分離します。 小腸から動脈を縛ることの後、コロンを削除します。 下腸間膜静脈や下腸間膜動脈の木を見つけるし、膵臓の尾側の表示場所 1 つの縫合糸で縛る。 脾動脈を結紮し、一緒に 1 つの縫合糸、門で、脾臓に近い静脈遠位脾を削除するハサミでカットします。 従い、十二指腸十二指腸と接続の葉が消去され、2 つの独立した縫合糸端で十二指腸を縛る。 門脈の解剖、肝臓からの血液流出を防ぐ、合字に近位にカットする 1 つの縫合糸で縛る。門脈は、decellularization 中にコンセントとして機能します。 解剖し、胆管および 2 つの縫合糸で肝動脈を結紮します。縫合糸に遠位カットします。 腎静脈下大動脈を見つけるそして膵領域に達するまで、筋肉や結合組織から頭蓋の方向にそれを解剖します。 優しく膵臓を裏返すし、SMA と CT をそのまま維持する大動脈の解剖 CT よりも優れてとハサミで SMA に劣る大動脈をカットします。 残りのはさみで周囲の組織を切り取って膵臓を取り出します。 4 mm 切開カニューレに接続して 50 mL の注射器を使用して、それは全体の器官を perfuses まで、または全体の器官は寒くなるソリューション 2 大動脈を通じて器官のフラッシュします。 4. Decellularization のブタの膵臓の準備 4 ° c またはプロセス全体で氷の上は、膵臓を維持します。 はさみを使って十二指腸の縫合糸をカット、純水 25 mL ピペットを使用しての 50-150 mL をフラッシュすることによって食糧のそれをきれいにし再び縫合糸とそれを縛る。 大動脈の一端と漏れを防ぐために縫合糸で SMA と CT のほかすべての枝を縛る。 大動脈のもう一方の端から 4 mm 切開のカニューレを挿入し、縫合糸で結紮します。 Decellularization 設定を使用 20 mL/分で 1 時間のソリューション 3 膵灌流します。注: は、気泡が入らない膵臓そのソリューション 3 ポンプのチューブを自動設定します。器官のすべての側面からの漏れを捜し、縫合糸で門脈内を除くすべての開いている血管枝を縛る。 ソリューション 4-20 ° C で膵臓を凍結、decellularization の開始まで。 5 ブタの膵臓の decellularization 4 ° C で膵臓を解凍します。 まで洗剤インレット チューブで気泡は見てない 20 mL/分でソリューション 3 decellularization 設定で蠕動ポンプを実行します。 Decellularization コンテナーに膵臓を配置し、膵臓の大動脈に洗剤インレット チューブを接続します。4 ° C で 20 mL/分で一晩ソリューション 3 による血液灌流による臓器を洗う オルガンの部屋に残された解決策を注ぐ。 ソリューション 5 ソリューション 3 に置き換えるし、20 mL/分 4 ° C で 30 分間膵臓を灌流機関室でソリューションを注ぐ。 解決策 6 を追加し、20 mL/分 4 ° C で 8 h の膵臓を灌流機関室でソリューションを注ぐ。 20 mL/分 4 ° C で 96 h のソリューション 5 による血液灌流による臓器を洗う機関室でソリューションを注ぐ。 膵臓 DNase 処理に備える CaCl2と 37 ° C で 30 分間 MgCl2を含むダルベッコ PBS の 500 mL を再循環によって機関室でソリューションを注ぐ。 解決策 7 の 250 mL を追加し、37 ° C で 20 mL/分 4 h の膵臓を灌流機関室でソリューションを注ぐ。 20 mL/分 4 ° C で 120 h のソリューション 5 による血液灌流による臓器を洗う 短い期間のための 4 ° c または-20 ° c 長時間ソリューション 8 に器官を格納します。 6. Decellularization の検証 はさみを使用すると、膵臓のすべての葉から 3-10 mm 生検をカットし、室温で 48 時間ホルムアルデヒドでそれらを修正します。 15 分間超純水で部分を洗浄し、次の標準的なプロトコル、ティッシュ プロセッサで処理してパラフィンに埋め込みます。 ミクロトームを使用して 5 μ m のセクションをカットし、マイヤーのヘマトキシリンと 0.2% アルコール エオシン (HE) 次の標準プロトコルによって、それらを染色します。 核の消失を確認する顕微鏡の下でスライドを表示します。注: 同じ方法で処理された新鮮な組織から作品はコントロールとして核の有無の確認に使用できます。