Isolement et DÉCELLULARISATION d’un pancréas entier porcin

La dissection d’un pancréas porcin et la procédure de DÉCELLULARISATION présentées ici suivez les directives éthiques de l’Université de Göteborg. 1. préparation de la mise en place de DÉCELLULARISATION À l’aide de tubes de silicone de 3 x 5 mm, se raccordent en série le réservoir de détergent d’entrée de la pompe peristalic et ensuite du pancréas à l’orgue de chambre via le dégazeur (voir Figure 1). Connecter un luer mâle à l’extrémité libre du tube dans la chambre de l’orgue. À l’aide d’un autre tube de silicone de 3 x 5 mm, connectez la chambre d’orgue à la sortie de détergent contenant via la pompe péristaltique pour recueillir le détergent perfusé. Connecter une pipette de 2 ml sans étiquette aux extrémités libres des tubes d’aspiration détergent contenant et détergent sortie Container. Garder la configuration entière à 4 ° C. Figure 1 : préparation de la mise en place de perfusion. En utilisant un tube de silicone de 3 x 5 mm, comme indiqué dans la mise en place, se raccordent en série le réservoir de détergent d’entrée de la pompe péristaltique, le dégazeur et la chambre de l’orgue. Les flèches noires indiquent la direction du flux du conteneur d’aspiration détergent à chambre d’orgue. Pour la sortie de détergent, utilisez un autre tube de silicone de 3 x 5 mm et branchez l’orgue chambre via la pompe péristaltique au conteneur de détergent prise. Les flèches rouges indiquent le sens d’écoulement de l’alvéole de l’orgue au conteneur de détergent prise. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure. 2. préparation des Solutions de DÉCELLULARISATION Solution 1 (tampon phosphate salin [PBS]) : ajouter 8 g de chlorure de sodium (137 mM), 0,2 g de chlorure de potassium (2,7 mM), 1,44 g de phosphate de sodium (10 mM) et 0,24 g de phosphate de potassium (1,8 mM) à 1 L d’eau ultrapure et remuer jusqu’à dissolution. Ajuster le pH à 7,4 avec l’acide chlorhydrique (HCl). Au total, 3,2 L de cette solution est nécessaire. Solution 2 (PBS + héparine) : pour 1 L de Solution 1, ajouter 3,4 mL d’héparine (17 unités internationales [UI] / ml). Préparer cette solution fraîche et gardez-le sur la glace jusqu’à ce qu’elle devienne froide. Au total, 1,2 L de cette solution est nécessaire. Solution 3 (eau ultrapure, azoture de sodium + disodique acide éthylènediaminetétracétique [EDTA]) : pour 1 L d’eau ultrapure, ajouter 1,86 g d’EDTA (5 mM) et 200 mg d’azide de sodium (0,02 %). Remuer jusqu’à ce que les sels sont dissous. Refroidir la solution à 4 ° C avant utilisation. Au total, 22 L de cette solution est nécessaire. Solution 4 (PBS + azide de sodium, EDTA) : pour 1 L de Solution 1, ajouter 200 mg d’azide de sodium (0,02 %) et 1,86 g d’EDTA (5 mM). Remuer jusqu’à ce que les sels sont dissous. Refroidir la solution à 4 ° C avant utilisation. Au total, 1 L de cette solution est nécessaire. Solution 5 (eau ultrapure + azide de sodium) : À 1 L d’eau ultrapure, ajouter 200 mg d’azide de sodium (0,02 %). Remuer jusqu’à ce que les sels sont dissous. Refroidir la solution à 4 ° C avant utilisation. Au total, 260 L de cette solution est nécessaire.NOTE : EDTA forme un précipité avec la DDC et a été exclu de la Solution 5 car il sera utilisé pour un lavage immédiat avant et après le traitement de la DDC. Solution 6 (DDC + Triton X-100) : De 940 mL d’eau ultrapure, ajouter 40 g (4 %) DDC, 60 mL (6 %) X-100 Triton, 200 mg d’azide de sodium (0,02 %) et 69,6 mg de fluorure de phénylméthylsulfonyle (0,4 mM) (PMSF). Remuer jusqu’à dissolution. Refroidir la solution à 4 ° C avant utilisation. Ajouter PMSF avant utilisation. Au total, 9,6 L de cette solution est nécessaire. Solution 7 (DNase) : Unités ajouter 10 000 Kunitz de DNase-je dans 250 mL de PBS de Dulbecco (Kunitz 40 unités/mL) contenant de CaCl2 et MgCl2. Préparer fraîche et utiliser immédiatement. Chauffer la solution à 37 ° C avant utilisation. Solution 8 (PBS + sodium azide) : pour 1 L de Solution 1, ajouter 200 mg d’azide de sodium (0,02 %). Remuer jusqu’à ce que les sels sont dissous. Refroidir la solution à 4 ° C avant utilisation. Au total, 1 L de cette solution est nécessaire. 3. dissection du pancréas porcin Remarque : Dans cette étude, pancréas porcins ont été disséqués d’euthanasiés, cochons femelles hépariné (400 UI/kg), pesant 45 kg provenant d’une ferme. Placez le cochon sur la table de dissection en décubitus dorsal. Faire une incision médiane du processus xiphoidal à l’os pubien (environ 40 cm) à l’aide d’un scalpel, exposer tous les organes abdominaux. Localiser le splénique duodénales et lobes de connexion. Repérer le niveau de la papille duodénale majeure et ligaturer le duodénum par voie orale à partir de ce site à l’aide de deux sutures séparés. Ligaturer l’oesophage inférieur avec deux sutures séparés et couper entre les ligatures avec des ciseaux pour sortir de l’estomac. Séparer le tissu conjonctif du colon pour atteindre l’intestin grêle. Séparer le tissu conjonctif du côlon qui s’attache au lobe splénique du pancréas. Enlever le côlon de l’intestin grêle après ligature des artères. Trouver la veine mésentérique inférieure et l’arbre de l’artère mésentérique inférieure et ligaturer avec une suture où ils apparaissent en direction caudale du pancréas. Ligaturer l’artère splénique et la veine avec une suture, près de la rate, dans le hile et couper dans la partie distale avec des ciseaux pour enlever la rate. Suivez le duodénum jusqu’à ce que les lobes duodénales et de connexion sont effacés et ligaturer le duodénum à la fin avec deux sutures séparés. Disséquer la veine porte, elle ligaturer avec une suture pour éviter toute fuite de sang par le foie et les couper dans la partie proximale à ligature. La veine porte sert une prise pendant la DÉCELLULARISATION. Disséquer et ligaturer le canal cholédoque et l’artère hépatique avec deux sutures. Couper dans la partie distale de sutures. Trouver l’aorte sous la veine rénale et il disséquer en direction crâniale du muscle et du tissu conjonctif, jusqu’à ce qu’il atteigne la région pancréatique. Retournez le pancréas doucement et disséquer l’aorte, conservant la SMA et le CT et couper l’aorte supérieur à CT et inférieur à SMA avec des ciseaux. Couper les autres tissus environnants avec des ciseaux et extraire le pancréas. À l’aide d’une seringue de 50 mL, reliée à l’artériotomie 4 mm canule, rincer l’organe par l’intermédiaire de l’aorte avec 2 Solution jusqu’à ce qu’il alimente l’organe entier ou jusqu’à ce que l’organe entier devient froid. 4. préparation du pancréas porcin DÉCELLULARISATION Gardez le pancréas à 4 ° C ou sur la glace tout au long du processus. Couper les sutures du duodénum à l’aide de ciseaux, nettoyez-le de nourriture par la chasse d’eau 50-150 mL d’eau ultrapure à l’aide d’une pipette 25 mL et ligaturer il nouveau avec des sutures. Ligaturer une extrémité de l’aorte et de toutes les directions sans compter que le SMA et le CT avec des sutures pour éviter les fuites. Insérez l’autre extrémité de l’aorte une canule artériotomie 4 mm et il ligaturer avec sutures. Perfuse le pancréas avec la Solution 3 pendant 1 h à 20 mL/min à l’aide de la mise en place de DÉCELLULARISATION.NOTE : Pré-remplir les tubes de pompe avec la solution 3 tels qu’aucune bulle d’entrer dans le pancréas. Rechercher les fuites de tous les côtés de l’orgue et ligaturer les branches vasculaires tous ouverts avec des sutures, sauf la veine porte. Congeler le pancréas à-20 ° C en Solution 4 jusqu’au début de la DÉCELLULARISATION. 5. DÉCELLULARISATION du pancréas porcin Décongeler le pancréas à 4 ° C. Faire fonctionner la pompe péristaltique dans la mise en place de DÉCELLULARISATION avec la Solution de 3 à 20 mL/min jusqu’à ce qu’aucune bulle d’air n’est visibles dans le tube d’aspiration de détergent. Placer le pancréas dans le récipient de DÉCELLULARISATION et connecter le tuyau d’aspiration de détergent à l’aorte du pancréas. Laver l’organe par une perfusion de Solution 3 nuit à 20 mL/min à 4 ° C. Versez la solution laissée dans la chambre de l’orgue. Remplacer la Solution 3 par 5 Solution et perfuse le pancréas pendant 30 min à 20 mL/min à 4 ° C. Versez la solution dans la chambre de l’orgue. Ajouter 6 Solution et perfuse le pancréas pendant 8 h à 20 mL/min à 4 ° C. Versez la solution dans la chambre de l’orgue. Laver l’organe par une perfusion de Solution 5 pendant 96 h à 20 mL/min à 4 ° C. Versez la solution dans la chambre de l’orgue. Préparer le pancréas pour le traitement de la DNase par recirculation 500 mL de PBS de Dulbecco contenant CaCl2 et MgCl2 pendant 30 min à 37 ° C. Versez la solution dans la chambre de l’orgue. Ajouter 250 mL de Solution 7 et perfuse le pancréas pendant 4 h à 20 mL/min à 37 ° C. Versez la solution dans la chambre de l’orgue. Laver l’organe par une perfusion de Solution 5 120 h à 20 mL/min à 4 ° C. Stocker l’orgue dans la Solution 8 à 4 ° C pendant de courtes périodes ou à-20 ° C pendant de longues périodes. 6. vérification de DÉCELLULARISATION À l’aide de ciseaux, couper les biopsies de 3 à 10 mm de tous les lobes du pancréas et fixez-les en formaldéhyde pendant 48 h à température ambiante. Laver les morceaux dans de l’eau ultrapure pendant 15 min, les traiter dans un traitement de tissus, suite de protocoles standard et les intégrer à la paraffine. Couper des sections de 5 µm en utilisant microtome et leur tache par hématoxyline et 0,2 % alcoolique éosine Meyer (HE) à la suite de protocoles standard. Visionner les diapositives sous un microscope optique pour vérifier la perte de noyaux.Remarque : Un morceau d’un tissu frais transformé de la même manière peut servir comme un contrôle pour vérifier la présence de noyaux.