Weefselengineering van de hele alvleesklier is een uitdaging vanwege zijn exocrine en endocriene functies. Laten we een methode voor de dissectie van een intact varkens alvleesklier en het proces van succesvolle decellularization door perfusie van detergentia Triton X-100, natrium-deoxycholate, en deoxyribonuclease.
Weefselengineering van de hele alvleesklier kunt verbeteren huidige behandelingen voor diabetes mellitus. Het uiteindelijke doel is om weefsel ingenieur alvleesklier van een allogene of XENOGENECELLEN bron met menselijke cellen. Een demonstratie van methoden voor de efficiënte dissectie, decellularization en recellularization van varkens alvleesklier zouden kunnen profiteren van het veld. Verwant aan het menselijke pancreases, varkens pancreases hebben een speciale anatomische regeling met drie lobben (milt, duodenale, en verbinding) afgerond door de twaalfvingerige darm en dunne darm. De duodenale kwab van de alvleesklier maakt verbinding met de twaalfvingerige darm verschillende kleine bloedvaten. Weefselengineering van de alvleesklier is ingewikkeld vanwege haar exocrine en endocriene karakter. In deze paper tonen we een gedetailleerd protocol om te ontleden de hele varkens alvleesklier en decellularize het met detergenten tijdens het opslaan van haar structuur en sommige componenten van de extracellulaire matrix. Om te bereiken volledig perfusie, is de aorta gekozen als de inlaat en de portal vein als uitlaatklep. De andere bloedvaten (hepatische slagader ader van de milt, milt slagader, mesenterische slagader en ader boom) en gal duct als ligatuur zijn verbonden. Voorkom de vorming van trombose en het varken is EDTA en onmiddellijk na dissectie, het orgel is gespoeld met koud heparine. Om te remmen de werking van exocrine enzymen, de decellularization van de alvleesklier ligt bij 4 ° C. De decellularization wordt uitgevoerd door perfusie van Triton X-100, natrium deoxycholate en deoxyribonuclease, met een intermitterende en laatste uitgebreide wassen. Met een succesvolle decellularization, de alvleesklier wordt wit weergegeven, en een histologische evaluatie met haematoxyline en eosine toont een gebrek aan kernen met een bewaarde extracellulaire matrix-structuur. Dus, de voorgestelde methode kan worden gebruikt om te succesvol te ontleden en decellularize hele varkens alvleesklier.
Diabetes mellitus wordt gekenmerkt door de aanwezigheid van glucose in het bloed wordt verbeterd. Het is erkend als een belangrijke volksgezondheid uitdaging in de meeste landen1. Hoge niveaus van de bloedglucose invloed op de bloedvaten en het zenuwstelsel, waardoor schade aan de ogen, het hart, de nieren en extremiteit ischemie. Traditionele methoden van behandeling omvatten injecties van exogeen insuline, drugs, en veranderingen in levensstijl. Het wegzetten een remedie voor de ziekte, in sommige gevallen, falen beschikbare behandelingen om de insuline op therapeutische niveaus, wat resulteert in hyperglykemie. Hoewel de transplantatie van eilandjes of hele alvleesklier de ziekte elimineert, is het niet vaak gedaan vanwege een gebrek aan geschikte donor-organen en de risico’s en moeilijkheden van immuunsuppressie en inkapseling2.
Huidige verbeteringen op het gebied van engineering en regeneratieve geneeskunde van weefsel beschikken over de capaciteit voor het verstrekken van een oplossing voor deze problemen. Met de techniek van decellularization, het celmateriaal van een mens of dier donor kan worden verwijderd terwijl de belangrijke extracellulaire matrix (ECM) eiwitten, groeifactoren, en signalering moleculen worden bewaard in de steiger. Dergelijke steigers kunnen mogelijk worden getransplanteerd zonder de noodzaak voor immuunsuppressie, de orgaanfunctie herstellen na recellularization met de geadresseerde eigen niet-immunogene stamcellen3,4. De weefsel-engineered organen van allogene of XENOGENECELLEN bronnen kunnen worden gebruikt in de klinische transplantatie, zoals de grote extracellulaire matrix eiwitten tussen soorten zijn bewaard en kunnen niet worden afgewezen na transplantatie5.
Decellularization is een goed onderzocht methode waarbij het optimale gebruik van de fysieke krachten, chemische reinigingsmiddelen en enzymen in een fysiologische omgeving om cellen en nucleair materiaal uit een weefsel of orgaan. Recellularization is een procedure voor het zaaien van de cellen terug in het Acellulair orgel. Het is een intellectueel taai geding, wordt gelast een groot aantal cellen, een optimale strategie voor cel-zaaien en een bioreactor systeem voor de cultuur van het orgel in fysiologisch aanvaardbare omstandigheden zoals temperatuur, druk en gassen6.
De alvleesklier kan een uitdagende weefsel voor weefselengineering vanwege haar exocrine en endocriene vermogens worden beschouwd. Het exocrine weefsel scheidt meerdere spijsverteringsenzymen, terwijl het endocriene deel hormonen scheidt, met inbegrip van insuline. De decellularization van intacte pancreases van muis7,8, menselijke9en varken10 reeds gerapporteerd met behulp van enzymen (trypsine, deoxyribonuclease [DNase]) en de niet-ionogene (Triton X-100) en de Ionische detergentia ( natrium deoxycholate [SDC] en natrium dodecyl sulfaat [SDS]). Echter, naar aanleiding van de gepubliceerde protocollen worstelde we met een succesvolle dissectie en volledige perfusie en decellularization terwijl het handhaven van een ECM-structuur. Wij speculeerden dat de toegepaste detergentia tijdens de decellularization veroorzaken lysis van de cellen, waardoor het vrijgeven van spijsverteringsenzymen in het orgel. De vrijgegeven enzymen zal leiden tot een onomkeerbare schade aan de ECM-steiger en inefficiënte voor decellularization en recellularization. Een ontwerp van de methode die effectief decellularizes alvleesklier tijdens het remmen de werking van spijsverteringsenzymen, kan het probleem oplossen. We kozen de strategie van Peloso et al., van decellularization van de pancreas bij een koude temperatuur, hoewel ze heeft geen verslag over waarom koude temperatuur gebruikte9is. Op hetzelfde moment ontwierpen we een dissectie strategie met wijzigingen van Taylor et al. door te kiezen voor de aorta als een perfusie inlaat over de coeliakie stam (CT) en de superieure mesenterische slagader (SMA)11.
In een recent gepubliceerd artikel12tonen we een methode voor de effectieve isolatie en decellularization van varkens alvleesklier met behoud van sommige onderdelen van de ECM. In dit document, wij geven een gedetailleerde beschrijving van hoe een hele varkens alvleesklier met milt, duodenale ontleden en verbinding lobben en presenteren van een stapsgewijze protocol voor succesvolle decellularization.
Het voorgestelde protocol, met behulp van perfusie van SDC en Triton X-100 bij 4 ° C, zullen hele varkens alvleesklier met succes decellularize. De uitdaging in deze techniek is de dissectie van de intact alvleesklier met alle de drie lobben zonder beschadiging van de parenchym en haar verstrekkende vaartuigen, evenals de afbinding van de andere vasculaire takken van het model om het perfuse van het orgel zonder lekkage. De varkens alvleesklier heeft een verschillende anatomie in vergelijking met de menselijke alvleesklier. Het bestaat uit drie lobben en blijft in nauw contact met de dunne darm door deels eromheen. We ontleed de twaalfvingerige darm samen met de alvleesklier, net als verschillende kleine bloedvaten uit alvleesklier verbinding de darm. Tijdens de optimalisatie studies, heeft stomp snijden van deze bloedvaten aangetoond lekkage en een onvolledige perfusie van oplossingen.
Aangezien de aorta verbinding met de alvleesklier via de coeliakie en superieure mesenterische slagaders maakt, kozen we de aorta als een inham eenvoudig te houden de perfusie door slechts met behulp van een canule en dus een inlaat. In onze ervaring, Afbinding van de aorta boven de CT en onder de SMA zal het verminderen van de tijd van dissectie en vermindert het risico van beschadiging van een van de twee schepen. Naast een heparinized varken, wij ook gemerkt dat een perfusie van koude heparine via de aorta onmiddellijk na de dissectie helpt bij het bereiken van de perfusie van oplossingen in het orgel. Wij speculeren dat als dit gebeurt doordat de vorming van bloedstolsels in de bloedvaten. De eerste perfusie van een alvleesklier met ultrazuiver water na dissectie zal lyse van rode bloedcellen en verwijder de resten van het bloed in het orgaan, waardoor de vorming van bloedstolsels. Deze periode kan ook worden gebruikt om te vinden van unligated kleine zijtak van de aders en slagaders, zoals bloedstroom kan gemakkelijk worden opgemerkt boven de achtergrond.
Wij kozen om te houden van de hele decellularization-procedure bij koude temperaturen (4 ° C), zoals dit zal een belemmering vormen voor de werking van exocrine enzymen die bij exocrine cellen van de pancreas vrijkomt. De exocrine enzymen, wanneer niet wordt geremd, kunnen leiden tot een schadelijke werking op cellen en de ECM, zoals zij celmembranen en eiwitten12 verteren kunnen. Invriezen en ontdooien effectief de cellen barsten kunnen, we opgenomen een vorst/dooi-stap, aanvankelijk nog vóór de perfusie van detergentia4,13. De eerste wassen na het ontdooien zal het verwijderen van de overblijfselen van cel uitbarstingen. Het wasmiddel behandeling die we gebruikten is een mix van SDC en Triton X-100 bij ongewoon hoge concentraties en bij een hoge perfusie-snelheid. Wij kozen deze benadering tot snellere decellularization door het verwijderen van de exocrine cellen die schade toebrengen aan de ECM. We speculeren dat een harde en snelle protocol gunstig voor alvleesklier decellularization, is zoals minder tijd beschikbaar voor enzymen van de alvleesklier om te interageren met de ECM zijn zal, dus behoud van goede ECM componenten. Om te bewaren de ECM-onderdelen, wij ook toegevoegd serine proteaseinhibitor (PMSF) aan het wasmiddel oplossingen, zoals die de activering van de enzymen die vrijkomen uit exocrine cellen14 remmen zal. Natriumazide wordt toegevoegd aan alle decellularization oplossingen, zoals het fungeert als een bacteriostatische agent, waardoor de remming van de kans op bacteriële besmetting15.
De alvleesklier decellularized volgens dit protocol toonde een behoud van ECM structuren en de ECM eiwitten collageen en elastine. Echter werd een aanzienlijk verlies van glycosaminoglycanen opgemerkt in de decellularized alvleesklier. De alvleesklier decellularized op deze manier ook toonde belofte voor de bevestiging van menselijke foetale pancreatic cellen van de stam en de expressie van exocrine en endocriene markers in recellularized voor 14 dagen12stukken. Verder onderzoek is echter voor het genereren van een intact en functionele alvleesklier, vereist bij de evaluatie van de juiste cel bronnen, celtypes, cel seeding strategieën en bioreactor cultuur.
The authors have nothing to disclose.
Deze studie werd gefinancierd door een subsidie van de Zweedse regering LUA ALF S.S.H.
4mm DLP arteriotomy cannula | Medtronic | 31104 | |
2ml Unlabelled pipette | vWR | 612-3720 | |
Degasser | Biotech AB | 0001-6484 | |
DNase-I | Worthington | LS0020007 | |
Dulbecco's PBS with CaCl2 and MgCl2 | Sigma Aldrich | D8662 | |
EDTA disodium salt dihydrate | AlfaAesar | A15161.OB | |
Heparin | Leo | 387107 | |
Luer Male with 1/8" ID Barb | Oina | LM-2PP-QC | For 3X5mm silicon tube |
Peristaltic pump | Oina | SP-1X4 | |
PMSF | Roche | 10837091001 | Unstable in aqueous solution. Should be added fresh before perfusion. |
Potassium chloride | Sigma Aldrich | P5405 | |
Potassium hydrogen phosphate | Sigma Aldrich | P9791 | |
SDC | Sigma Aldrich | 30970 | |
Silicon tube 3X5mm | VWR | 2280706 | |
Sodium Azide | Sigma Aldrich | 71290 | |
Sodium chloride | Sigma Aldrich | 13423 | |
Sodium hydrogen phosphate | Merck | 71640-M | |
Suture | Vömel | 14817 | |
Syrringe 50mL | Becton Dickinson | 300137 | |
Triton-X-100 | AlfaAesar | A16046.OF |