Génération de cellules humaines de ressemblant cellules germinales primordiales à la Surface du corps embryoïdes de pluripotence amorcée induite par les cellules souches pluripotentes

1. cellules Culture de hiPSCs dans l’état de pluripotence Primed Préparation de plats enduit de protéines de la matrice extracellulaire Décongeler le Matrigel (protéine de la matrice extracellulaire) sur la glace dans un réfrigérateur ou une chambre froide pendant la nuit (ne pas dégeler à température ambiante ou à l’aide d’un bain d’eau chaude). Protéine de la matrice aliquote (~ 200 μL ; le volume de l’aliquote est déterminé par le fabricant pour chaque lot et indiqué sur l’étiquette du flacon) dans des tubes à centrifuger de basse-bind stérile ou tubes de cryoconservation de cellules sur la glace. Il est important de garder les protéines de la matrice extracellulaire glacée durant la distribution afin d’éviter la solidification. Stocker les aliquotes à-80 ° C. Pour enrober la cellule en plastique pétri avec les protéines de la matrice extracellulaire, diluer une aliquote avec 25 mL glacée DMEM/F12 et propagation à trois plats de 10 cm (environ 8 mL/boîte). Incuber les plats à température ambiante pendant au moins 1 heure. Après le revêtement, plats peuvent être scellés à l’aide de Parafilm et conserver à température ambiante jusqu’à une semaine. Aspirer le moyen de vaisselle immédiatement avant l’inoculation de pluripotence apprêté hiPSCs. Il n’est pas nécessaire de laver la vaisselle couchée avec support ou une solution saline tamponnée au phosphate sans calcium/magnésium [PBS(-)]. Initiation de la culture de hiPSC dans l’état de pluripotence apprêté Ajouter 2 µL de 50 mM Y27632 [inhibiteur de la protéine associée à Rho kinase (ROCK)] dans 10 mL de milieu de mTeSR1 dans un tube à centrifuger de 15 mL. Préparer deux tubes de ROCK additionnés d’inhibiteur de 10 mL de milieu d’ouvrir la culture de cellules dans un plat de 10 cm de 1 mL congelé stock cellulaire. Utiliser Y27632-complété le même jour. Préchauffer le milieu additionné de Y27632 dans un bain-marie à 37 ° C pendant 5 min.Remarque : Ce protocole fonctionne bien avec hiPSCs maintenu en mTeSR1. Lorsque hiPSCs sont maintenues dans d’autres médias soutenant la croissance humaine CFP avec différents degrés d’apprêté ou naïf pluripotence, rendement de hPGCLCs peut-être varier considérablement.Remarque : La durée de conservation de mTeSR1 complet est 2 semaines à 4 ° C et 6 mois à-20 ° C, mais re-congélation causes mauvaise performance. Nous gelons 40 ml de mTeSR1 à-20 ° C jusqu’à l’utilisation. Décongeler un flacon de pluripotence apprêté hiPSC congelés stock (1,0 à 3,0 x 106 cellules dans 1 mL de milieu de cryoconservation) à l’aide d’un bain-marie à 37 ° C. Immédiatement après l’achèvement de la fonte, transférer tout le contenu d’un flacon dans un tube (10 mL) de préchauffée milieu additionné de Y27632. Suspension de cellules de centrifugeuse à température ambiante, 300 x g pour 8 min. jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire 10 ml préchauffé additionné de Y27632 de l’autre tube. Étendre uniformément la suspension cellulaire dans un plat de 10 cm de protéine-enduit matrice extracellulaire. Placer le plat dans un incubateur à CO tri-gaz2 (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % de CO2). Maintenir la culture hiPSC sous une pression de faible teneur en oxygène. Moyen de changement (mTeSR1 sans Y27632) tous les jours. L’inhibiteur de la roche (Y27632) est critique pour la survie de hiPSC immédiatement après la dissociation en cellules individuelles. Une fois que hiPSCs adhérer sur la surface d’enduit de protéine de matrice extracellulaire comme répartis uniformément petits agrégats avec > confluence de 10 % (ce qui est généralement réalisé dans les 16 heures après l’inoculation), Y27632 est dispensable. Changement médiatique trop tôt après l’inoculation de dissocié hiPSCs sans Y27632 peut provoquer la mort cellulaire presque complète. Passaging amorcée pluripotence hiPSCsRemarque : Passage amorcée pluripotence hiPSCs lorsque les colonies occupent environ 80 % de la surface de croissance efficace. Les densités et les procédures de passage corrects est important pour la reproductibilité expérimentale. Nous avons vu que l’efficacité de l’induction de hPGCLC n’est pas significativement différente entre les cultures de hiPSC 6 jours après le début d’un stock congelé (impliquant un ou deux passages) ou d’un mois (impliquant > 10 passages). Induction de hPGCLC a été effectuée avec succès de hiPSCs maintenue pendant plus de deux mois, même si l’efficacité n’a pas été évaluée quantitativement. Prenez 4 mL de mélange d’enzymes dissociation cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL et est proportionnelle à la température ambiante pendant 5 min. Préchauffer 10 mL PBS(-) dans une centrifugeuse 15 mL tube depuis > 5 min à 37 ° C dans un bain d’eau. Ajouter 2 µL de 50 mM Y27632 (inhibiteur de la roche) au milieu de mTeSR1 de 10 mL dans un tube à centrifuger de 15 mL. Préparer deux tubes du milieu ROCK additionnés d’inhibiteur de 10 mL et utiliser dans la même journée. Dans un autre tube à centrifuger de 15 mL, prendre 5 mL mTeSR1 sans ajouter Y27632. Préchauffer la moyenne +/-Y27632 dans un bain-marie à 37 ° C pendant 5 min.Note : Tous les aliquotes moyens établis à l’étape 1.3.3 peuvent contenir Y27632. Aspirer le vieux moyen d’a 10 cm plat et rincer les cellules une fois avec préchauffée 10 mL PBS(-). Jeter les PBS(-) et ajouter 4 mL d’enzyme de dissociation au plat. Placer le plat dans un incubateur à CO2 (incubateur de tri-gaz fonctionne, mais pas nécessaire) de ~ 4 min jusqu’à ce que les cellules se détachent du fond. Doucement les cellules de pipette up et down pour faire suspension monocellulaire. Transférer suspension monocellulaire hiPSC au tube préchauffée contenant 5 mL de milieu sans Y27632 (volume total dans un tube de 15 mL est d’environ 9 mL). Centrifuger la suspension de cellules à température ambiante, 300 x g pendant 8 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 10 mL de milieu moyen préchauffée contenant Y27632. Enlever des agrégats cellulaires à l’aide d’une passoire de cellule de 40 µm et déterminer la densité des cellules en utilisant un compteur Coulter. Diluer la suspension cellulaire avec préchauffée milieu additionné de Y27632 pour atteindre 3,0 x 106 cellules dans 10 mL d’inoculer un plat de 10 cm enduit de protéines de la matrice extracellulaire. Placer la capsule inoculée dans un incubateur à CO tri-gaz2 (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % de CO2). Moyen de changement (mTeSR1 sans Y27632) tous les jours. 2. génération de hPGCLCs Remarque : Effectuer les étapes suivantes lorsqu’hiPSC cellules dans un plat de 10 cm (moyenne mTeSR1, enduit de protéines de la matrice extracellulaire) atteint à la confluence de ~ 80 % (environ 107 cellules). Préparation de plats d’enduit de protéines de la matrice extracellulaire (jour 1) Décongeler une aliquote de protéine de la matrice extracellulaire sur la glace et diluer 25 mL de DMEM glacee/F12. Verser les protéine de la matrice extracellulaire diluée à 6 plats (1 mL/puits). Une aliquote est suffisante pour recouvrir les 24 puits (4 plaques). Incuber les plaques à température ambiante pendant au moins 1 heure. Plaques revêtues inutilisés peuvent être scellés et conserver à température ambiante jusqu’à une semaine. Aspirer le milieu à partir de plaques immédiatement avant l’inoculation de pluripotence apprêté hiPSCs. Il n’est pas nécessaire de laver la vaisselle couchée avec support ou PBS(-). Inoculation de pluripotence apprêté hiPSCs en plaques d’enduit de protéines de la matrice extracellulaire (jour 1) Prenez 4 mL d’enzyme de dissociation cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL et est proportionnelle à la température ambiante pendant 5 min. Préchauffer 10 mL PBS(-) dans une centrifugeuse 15 mL tube depuis > 5 min à 37 ° C dans un bain d’eau. Ajouter 7 µL de 50 mM Y27632 (inhibiteur de la roche) dans 35 mL de milieu de mTeSR1 dans un tube à centrifuger de 50 mL. Utiliser Y27632-complétée dans la même journée. Faire deux tubes pour total 70 mL milieu supplémenté Y27632 et préchauffer le milieu dans un bain-marie à 37 ° C pendant 15 min. Aspirer le vieux moyen d’a 10 cm plat et rincer les cellules une fois avec préchauffée 10 mL PBS(-). Jeter les PBS(-) et ajouter 4 mL d’enzyme de dissociation cellulaire au plat. Placer le plat dans un incubateur à CO2 (incubateur de tri-gaz fonctionne, mais pas nécessaire) de ~ 4 min jusqu’à ce que les cellules se détachent du fond. Doucement les cellules de pipette up et down pour faire suspension monocellulaire. Transférer suspension monocellulaire hiPSC au préchauffée tube contenant 10 mL de milieu additionné de Y27632. Centrifuger la suspension de cellules à température ambiante, 300 x g pendant 8 min. Jeter le surnageant et resuspendre le culot cellulaire avec 10 mL de milieu de Y27632-complétée préchauffée. Filtrer sur un tamis de cellule (taille de pore de 40 µm) pour enlever des agrégats cellulaires et de compter les cellules en utilisant un compteur Coulter suspension cellulaire. Diluer la suspension monocellulaire hiPSC à 5,0 x 106 cellules dans un milieu additionné de Y27632 préchauffée 50 mL. Ensemencer la suspension de cellules de 2 mL (2,0 x 105 cellules) dans chaque puits des plaques 6 puits couchés (4 plaques, 24 puits). Assurez-vous que les cellules sont réparties uniformément dans chaque puits. Placer les plaques de culture cellulaire dans une étuve à2 tri-gas CO (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % de CO2).Remarque : La densité cellulaire inoculum et la répartition homogène dans chaque bien est essentiel. Parce que l’inoculation de la hiPSCs dans des plats de 10 cm peut provoquer la densité cellulaire nettement plus élevée que d’autres régions. Même la densité cellulaire de cellules individuelles hiPSCs peut être atteint plus facilement avec plaques 6 puits. Changer le milieu avec 2 mL/puits mTeSR1 (sans Y27632) à 24 heures après l’inoculation. Conversion de la pluripotence apprêtée état hiPSCs aux cellules pluripotentes 4i-naïf (ERK-indépendant) (jour 3 et jour 4) Préparer 4i naïf complet pluripotence milieu dans un tube à centrifuger de 50 mL comme suit (jour 3 et jour 4) : 50 mL de milieu basal 4i, 5 µL de 30 mM CHIR99021, 5 µL de 10 mM PD0325901, 5 µL de 20 mM BIRB796, 5 µL de 50 mM SP600125 et 5 µL de 50 mM Y27632.Remarque : Magasin 4i milieu basal à-80 ° C et décongélation au réfrigérateur toute la nuit. Préparer le milieu complet 4i frais immédiatement avant l’emploi. Éviter l’exposition des produits chimiques 4i (CHIR, PD, BIRB et SP) à une forte lumière. Ne stockez pas de 4i complet moyen à 4 ° C ou congelé pendant une nuit ou plus. Milieu complet de chaud 50 mL 4i dans un lot d’eau de 37 ° C pour 15 min. moyen de changement avec préchauffé 4i milieu complet (2 mL/puits) à 48 et 72 heures après l’inoculation. Timing des changement médiatique est important de parvenir à rendement élevé de hPGCLC et la reproductibilité expérimentale.Remarque : La densité de la culture de hiPSC 4i est élevée dans ces conditions et devenir confluente à 48-72 heures après l’inoculation, mais c’est normal. Formation EB à l’aide de plaques microwell (jour 5) Préparation de 50 mL de milieu complet 4i dans un tube à centrifuger de 50 mL et il préchauffer dans un bain d’eau de 37 ° C pendant environ 15 min avant utilisation. Réchauffer au préalable les 35 mL DMEM/F12 dans un tube à centrifuger de 50 mL dans un bain d’eau de 37 ° C pendant environ 15 min avant utilisation. Préparer une plaque de microtitration Ajoutez 5 % (p/v) stérilisée par filtration Pluronique F-127 détergent dans 8 puits actives d’une plaque de microtitration (voir Table des matières; 0,5 mL/puits). Centrifuger la plaque de microtitration à température ambiante, 1 000 g, pendant 5 min. Inspectez micropuits avec un microscope inversé pour s’assurer de l’absence de bulles d’air. Laisser la plaque de microtitration pendant 30 min à température ambiante pour recouvrir les puits avec du détergent. Jeter la solution détergente des puits de la plaque de microtitration par puits de pipetage et rincer avec préchauffée DMEM/F12 (2 mL/puits). Centrifuger la plaque de microtitration à température ambiante, 1 000 x g pendant 5 min. Inspectez micropuits avec un microscope inversé pour s’assurer de l’absence de bulles d’air.Remarque : Quand on observe encore des bulles d’air dans des micropuits, examiner si la feuille de microtitration est toujours fermement collée au fond du puits. Jetez DMEM/F12 de puits de la plaque de microtitration par puits de pipetage et rinçage avec préchauffée DMEM/F12 (2 mL/puits). Répétez les étapes 2.4.3.3 – 2.4.3.4. Ajouter 4i milieu complet dans les rincés au puits de la plaque de microtitration (1 mL/puits). Garder le milieu complet de 4i restants dans un bain-marie à 37 ° C. Centrifuger la plaque de microtitration à température ambiante, 1 000 x g pendant 5 min. Inspectez micropuits avec un microscope inversé pour s’assurer de l’absence de bulles d’air. Placer la plaque de microtitration dans un incubateur à tri-gaz (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % de CO2) jusqu’à ce que l’inoculation de 4i hiPSCs. Inoculation de 4i CISP dans une plaque de microtitration Prenez les 13 mL d’enzyme de dissociation cellulaire dans un tube à centrifuger de 15 mL et est proportionnelle à la température ambiante pendant 5 min. Préchauffer 50 mL PBS(-) dans une centrifugeuse 50 mL tube depuis > 5 min à 37 ° C dans un bain d’eau. Aspirer le vieux moyen de 24 puits de naïve hiPSC culture et rincer les cellules une fois avec préchauffée 2 mL/bien PBS(-). Jeter les PBS(-) et ajouter 0,5 mL/puits enzyme de dissociation. Placer les plaques de culture cellulaire dans un incubateur à CO2 (37 ° C) pendant environ 4 min jusqu’à ce que les cellules se détachent du fond. Doucement les cellules de pipette up et down pour faire suspension monocellulaire. Transfert en suspension monocellulaire hiPSC à milieu complet de 4i préchauffée 20 mL. Centrifuger la suspension de cellules à température ambiante, 300 x g pendant 8 min. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot cellulaire avec 5 mL de milieu complet de 4i préchauffée. Filtrer suspension cellulaire à travers un tamis de cellule (taille de pore de 40 µm) pour supprimer des agrégats cellulaires. Lavez tamis cellulaire 3 fois avec 1 mL de milieu complet de 4i préchauffée. Compter les cellules en utilisant un compteur Coulter. Diluer la suspension monocellulaire de 4i naïve hiPSCs à 27,0-32,4 x 106 cellules dans 9 mL de milieu complet de 4i préchauffée. Notez que milieu complet 4i contient déjà Y27632. Prendre la plaque de microtitration contenant 1 mL de milieu complet 4i 8 bien d’un incubateur de tri-gaz (2.4.3.9). Inoculer mL 1 4i naïve hiPSC suspension (3.0-3,6 x 106 cellules/puits) dans chaque puits. Cette densité cellulaire est critique. Assurez-vous que les cellules sont réparties uniformément dans chaque puits de pipetage doucement. Centrifuger la plaque de microtitration à température ambiante, 100 g pendant 3 minutes. Placer la plaque de microtitration dans une étuve à2 tri-gas CO (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % de CO2). Ne pas déranger les granulés dans des micropuits de cellules. Incuber les cellules pendant 24 à 30 heures. Une nuit d’incubation (environ 16 heures) est généralement insuffisante pour formation d’EBs serré. Transfert de l’EBs à plaques de fixation basse pour bascule culture (jour 6) Préparer le milieu complet hPGCLC dans un tube à centrifuger 50 mL comme suit (jour 6 – journée 13) :20 mL de milieu basal de hPGCLC, 4 μL de 500 mM 2-mercaptoéthanol, 50 μL de 20 mg/mL d’acide L-ascorbique, 4 μL de 50 mM Y27632, 50 μL de 100 μg/mL BMP4 humaine recombinante, 4 μL de 500 μg/mL humaine SCF, 4 μL de 250 μg/mL humaine EGF et 8 μL de 250 μg/mL FRV humaine.Remarque : Préparer le milieu complet hPGCLC frais immédiatement avant utilisation et éviter l’exposition à la lumière. Ne stockez pas de hPGCLC complet moyen à 4 ° C ou congelé pendant une nuit ou plus.Remarque : La concentration de BMP4 est très élevée. La concentration optimale de BMP4 peut-être différer entre les lots de BMP4. La différence de lot à lot de BMP4 affecter fortement la production de hPGCLC. En l’absence de BMP4 dans le milieu de hPGCLC complète, le rendement de hPGCLCs est très faible6. L’importance d’autres cytokines dans le milieu de hPGCLC complet a été décrit par Hanna/Surani6.Remarque : Dans ce protocole, la concentration finale de FRV humain dans le milieu hPGCLC complète est de 100 ng/mL6,10. La concentration finale de FRV utilisée dans les études déjà publiées, y compris la nôtre, était de 1 μg/mL. Quelle est l’activité spécifique du réactif de FRV humaine > 10 000 unités/μg (ED50 < 0,1 ng/mL), 100 ng/mL FRV est suffisante pour supporter la génération de hPGCLC de l’EBs. Transfert d’EBs Préchauffer le milieu basal de hPGCLC 5 mL et 20 mL de milieu complet de hPGCLC pour > 5 min à 37 ° C dans un bain d’eau. Placez délicatement une passoire de cellule à l’envers au sommet d’un tube conique polypropylène de 50 mL. Pipette de chaque puits de la microwell plaque très doucement plaque pour détacher EBs micropuits. Filtrer tous les contenus de chaque puits sur la crépine de la cellule pour éliminer les cellules non incorporés dans EBs. EBs laver accumulée sur la crépine de la cellule avec 1 mL de milieu de base hPGCLC préchauffée. Doucement le lavage répétez 5 fois. EBs lavées sont maintenant conservés sur la membrane d’une crépine, qui se trouve sur un tube conique de 50 mL à l’envers. Placer un nouveau tube conique de 50 mL sur la crépine de la cellule de sorte que la crépine de la cellule est normalement positionnée dans le nouveau tube. Puis rapidement inverser la crépine de la cellule avec le nouveau tube. La crépine de la cellule et le tube sont maintenant en position normale, et EBs sont au-dessous de la membrane de la crépine de la cellule. EBs s’accumuler dans le tube à fond conique en ajoutant le milieu complet de 18 mL hPGCLC préchauffée par dessus la membrane de la crépine de la cellule. Ainsi, moyen va passer à travers la membrane et de recueillir EBs attaché sur le côté inférieur de la membrane vers le bas de la tube à centrifuger. Suspension de la plaque d’EBs dans le puits d’une plaque de 6 puits de basse-attachment (3 mL/puits). Placer la plaque de fixation basse sur un balancier de déplacement à la balançoire dans un incubateur à tri-gaz (37 ° C, 6,5 % O2, 5 % de CO2). Régler la vitesse de balancement à ~ 20 tours / min.Remarque : Ne s’appliquent pas mouvement tourbillonnant car agrégat EBs au centre du puits et fusible. Ajuster soigneusement vitesse bascule afin que l’EBs ne s’agrègent pas. À bascule trop vigoureuse sera endommagé physiquement EBs.Remarque : La pression d’oxygène est fortement recommandée pour la culture de l’EB. Génération de hPGCLCs sur la surface de l’EBs (jour 7 – jour 13) Fraîchement préparer 20 mL de milieu complet de hPGCLC chaque jour. Sans bascule, EBs sera précipité au fond des puits dans ~ 1 min. retirer ancien milieu sans séchage EBs (~0.2 mL/puits vieux moyen peut rester) et ajoutez les frais hPGCLC milieu complet tous les jours (3 mL/puits). 3. Immunohistochemical souillant d’EBs (jour 10 – jour 13) EBs encastrement dans des blocs de protéine de matrice extracellulaire pour formaldéhyde-fixes et paraffine immunostaining (FFIP) Pour identifier les hPGCLCs comme OCT4+ cellules, récolter EBs dans un tube de microcentrifuge basse-lier de 1,5 mL. Laissez EBs couler au fond ou brièvement centrifuger (2 secondes) à la température ambiante et ne du milieu. Rincez EBs avec PBS(-) glacée. Supprimer PBS(-) et incuber EBs dans 1 mL d’azide de sodium 1%(w/v) glacée au PBS(-) pendant 5 min sur la glace. Laisser l’EBs couler au fond ou centrifuger brièvement (2 secondes) à la température ambiante. Jeter le surnageant et rincer EBs avec PBS(-) glacée.Remarque : Ajout de l’azide de sodium ralentit la dégradation des protéines intracellulaires et ARN transcrits. Décongeler les 200 µL de protéine de la matrice extracellulaire sur la glace et ajouter dans le tube de microcentrifuge contenant EBs. Maintenir le tube à température ambiante pendant environ 10 min jusqu’à ce que le gel est solidifié. Ajouter 1 mL de 4 % de formaldéhyde dans PBS(-) et incuber à température ambiante pendant 15 minutes avec le doux balancement.Note : Les EBs et les protéines de la matrice extracellulaire sont fixés au cours de cette étape. Sans fixation, les blocs de gel peuvent se décomposer pendant le processus de déshydratation. Si EBs prédéterminés sont intégrés dans le bloc de gel, EBs sont fixés à nouveau avec le bloc de gel et peut être trop fixe. Jetez de formaldéhyde et rincez EBs une fois avec PBS(-) glacée. Ajouter 1 mL d’éthanol à 70 %. EBs gel incorporés peuvent être stockés dans l’éthanol à 70 % à 4 ° C pendant une semaine. Traiter l’EBs gel-encastré avec un protocole standard de FFIP. Préparer 5 μm diapositives FFIP épaisseur. Laissez les diapositives sécher toute la nuit et les stocker à température ambiante jusqu’à immunostaining.Remarque : Notre routine protocole FFPE est comme suit : 70 % éthanol, deux changements, 1 heure chacune ; 80 % d’éthanol, un seul changement, 1 heure ; éthanol à 95 %, un changement, 1 heure ; 100 % éthanol, trois changements, 1,5 heure chacune ; xylène, trois changements, 1,5 heure chacune ; cire de paraffine (58-60 ° C), deux changements, environ 2 heures chacune. Les tissus déshydratés sont incorporés dans des blocs de paraffine et couper à 3-10 μm (typiquement 5 μm). Pour la coloration, glisse dans le four de 56 ° C pendant au moins 30 min Deparaffinize de sécher complètement et hydrater diapositives avec xylènes et série graduée de l’alcool. Puis les lames dans l’eau du robinet pendant 5 min. Pour inactiver les peroxydases endogènes, incuber les lames réhydratés avec Solution de blocage BLOXALL à température ambiante pendant 10 min. Puis laver les lames avec du PBS pendant 5 min. Bloc glisse avec sérum de cheval Normal (ou sérums normaux d’autres anticorps secondaire espèces générées) à température ambiante pendant 20 min. Incuber les lames avec un anticorps primaire anti-OCT-3/4 chèvre dilué avec 0,1 % de BSA dans PBS(-) à 4 ° C durant la nuit (optimiser les conditions de dilution et d’incubation pour chaque anticorps primaire). Laver ensuite les diapositives avec PBS(-) trois fois à la température ambiante, 5 min chacun. Incuber les lames avec le anti-chèvre IgG (anticorps secondaire couplé à la peroxydase au raifort générés par cheval ; voir Table des matières) à température ambiante pendant 30 min. Laver ensuite les diapositives avec PBS(-) trois fois à la température ambiante, 5 min chacun. Mélanger une quantité nécessaire la DAB coloration des substrats (voir Table des matières) immédiatement avant utilisation et incuber les lames en complet DAB coloration solution à température ambiante pendant 5 min. moniteur DAB coloration à l’aide d’un microscope inversé et arrêter la réaction Lorsque OCT4+ cellules sont visualisées en rinçant rapidement glisse dans l’eau qui coule du robinet. Déshydrater les lames avec une série graduée de l’alcool et les xylènes. Les diapositives sont prêts pour la microdissection laser-capture. Préparer permanente FFIP diapositives à l’aide du milieu de montage (voir Table des matières) pour les observations en microscopie à haute résolution. 4. enrichissement de FACS des hPGCLCs de l’EBs (jour 10 – jour 13) Préparer le mélange enzymatique de Kit de Dissociation corps embryoïdes Préparer, Enzyme Mix 1 en ajoutant 50 µL Enzyme P à 1 900 µL de tampon X et vortex. Préchauffer Enzyme Mix 1 dans un bain-marie à 37 ° C pendant 15 min. Préparer, Enzyme Mix 2 en ajoutant 10 µL Enzyme A à 20 µL de tampon Y. Mélanger mélanges Enzyme 1 et 2 pour préparer EB complète Dissociation enzymatique Mix. Se dissociant EBs EBs récolte de plaques de fixation faible et centrifuger à température ambiante dans un tube à centrifuger de 15 mL, 300 g de x pendant 2 min. jeter le surnageant et remettre en suspension EBs 10 ml PBS(-). Centrifuger à nouveau. Jeter le surnageant et remettre en suspension les EBs avec complet EB Dissociation enzymatique Mix (4.1.3). Incuber suspension EB dans un bain d’eau de 37 ° C pendant 15-20 min jusqu’à ce que l’EBs sont dissociées. Durant l’incubation, doucement la pipette EBs à toutes les 3-5 min pour faciliter la dissociation. Alternativement, utilisez un dissociator automatisé avec programme de Dissociation corps embryoïdes. Ajouter glacee 8 mL PBS(-) de suspension de cellules dissociée EB. Filtrer la suspension cellulaire à travers un tamis de cellule de 40 µm. Crépine de cellule laver avec 1 mL PBS(-) glacée trois fois. Compter les cellules en suspension de cellules filtrées à l’aide d’un compteur Coulter. Centrifuger la suspension cellulaire à 4 ° C, 300 x g pendant 8 min et jeter le surnageant. Resuspendre le culot cellulaire glacée 10 ml PBS(-). Suspension cellulaire divisent de deux tubes, un pour le contrôle non tachant (cellules de5 ~ 10) et l’autre pour anti-CD38 coloration (toutes les cellules restantes). Centrifuger les deux tubes à 4 ° C, 300 x g pendant 8 min. Anti-CD38 coloration et enrichissement des FACS de hPGCLCs Resuspendre le culot cellulaire pour le contrôle non tachant avec 200 µL glacée 3 % (p/v) BSA et azide de sodium 1 % (p/v) dans PBS(-). Placer sur la glace jusqu’en cytométrie en flux.Remarque : Ajout de l’azide de sodium ralentit internalisation de CD38 de surface cellulaire. Resuspendre le culot cellulaire pour anti-CD38 coloration et glacée 3 % (p/v) BSA azide de sodium 1 % (p/v) dans PBS(-) à 1 x 106 cellules / µL 100. Ajouter 10 µL par 1 x 106 cellules d’une note-FACS, anticorps anti-CD38 APC-conjugués. Couvrir le tube avec du papier aluminium pour éviter l’exposition à la lumière. Incuber à 4 ° C pendant 45 min avec le doux balancement. Ajouter 5 mL glacee PBS(-) et centrifuger à 4 ° C, 300 x g pendant 8 min. jetez surnageant et remettre cellule pellet 5 ml PBS(-) glacée. Répétez les laver avec de le PBS(-) trois fois au total. Resuspendre le culot cellulaire avec l’azoture de sodium 500 μL glacée 3 % (p/v) BSA et 1 % (p/v) dans PBS(-) à une densité suffisante pour FACS. Enrichir les hPGCLCs comme CD38+ cellules, qui forment généralement population cellulaire bien différenciées. Utilisez le contrôle non tachant pour assurer l’identification du CD38+ cellules. Un rendement typique de hPGCLCs sont de 1 à 5 % de toutes les FACS-examiné des cellules individuelles de jour 10 EBs et de 20 à 40 % de jour 13 EBs.