真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

1. デザイン アンチセンス オリゴヌクレオチド (ASOs) MRNA またはその38使用可能なオンライン ツールを使用してフラグメントの二次構造を分析します。したがって、空のボックスに塩基 (nt) を入力します。基本的なオプション ボックスで分離の塩基対を避けるため最低の自由エネルギー (MFE) とパーティション関数を選択します。出力オプション ボックスでインタラクティブな RNA 二次構造プロットを選択し、最後に進むボタンをクリックします。興味の mRNA の二次構造を表示する新しいウィンドウがポップアップします。 少なくとも 3 つの異なるに優先的に検出可能な二次構造に欠けている地域での興味の mRNA 内 21-24 nts 長いシーケンスを選択 (e.g。、構造化されていないループで) 非翻訳領域 (UTR) を 3 ‘ と。注: それ観察されている 3’ 非翻訳領域 (UTR) のシーケンスに焼鈍 ASOs は最善の実行します。1 つの可能性は、コーディング シーケンス (CD) にバインドされているリボゾームが ASOs の焼鈍を妨げる可能性があります時折です。5 ‘ UTRs 焼鈍 ASOs はテストしませんでした。 グアニジン/シトシン比 50% に近い地域を選択して、ヌクレオチド タンデムを欠けているヘアピンや自己アニーリングの潜在的な形成を避けるために繰り返されます。 手動でデザイン 2′-メトキシ変更軸受ビオチン基 3’、目的内の選択した領域 (ステップ 1.2) に完全に相補的な RNA オリゴヌクレオチド mRNA のターゲットします。注: 2’-メトキシ変更 RNA 耐性細胞 RNases をレンダリング、溶融温度の厳しい洗浄を可能にする二重が増加します。ビオチン基は、ストレプトアビジンと ASOs のキャプチャに必要です。 60 ~ 65 に RNA の雑種の融点を調整する ° C 高い言語シーケンスの複雑さがいることを確認し、(> 60%) 適切なオンライン ツール39で決定されました。 トランスクリプトームにおける他の Mrna と潜在的な麻生十字交配を検索する基本的なローカル配列検索ツール40を使用します。ヌクレオチド爆発、空のボックスでシーケンスを挿入し、興味の生物を選択します。残りのパラメーターの既定値としてし爆発をクリックします。注: 8-10 国税庁のでも、部分的に連続配置は十字交配、この mRNA の回復につながります。 2. 細胞培養、紫外線照射とセル換散 注: 次の手順は出芽酵母出芽酵母、線虫C. elegans、および人間の萌芽期の腎臓の細胞 (HEK293) については。それにもかかわらず、それは明示的にテストしていませんがまだは、同様に、他の生物に適応できます。 出芽酵母 酵母を育てる (e.g、ひずみ BY4743 派生物;。MATa/α his3Δ1/his3Δ1 leu2Δ0/leu2Δ0 LYS2/lys2Δ0 met15Δ0/MET15 ura3Δ0/ura3Δ0 PFK2:TAP/PFK2) 500 mL の YPD 培地で (1% 酵母エキス、ペプトン 2%、2 %d-グルコース) 220 rpm で一定の揺れで 30 ° c。 中間ログの段階で細胞を収集 (光学密度 600 nm (OD)600 〜 0.6) 0.45 μ m ナイロン フィルターを用いたろ過することによって部屋の温度 (RT) で 2 分間 3,000 × g で遠心分離します。それぞれフローを介して、または、上清を捨てます。 0.45 μ m ナイロン フィルターを用いたリン酸緩衝食塩 (PBS) 25 mL で 3 回セルを洗浄または RT で 2 分間 3,000 × g で遠心分離によって収集し、上澄みを廃棄します。できるだけ早く課されたストレスが RNA 蛋白質の相互作用に影響を与える可能性があります、セルを収集します。 25 mL の PBS で細胞を再懸濁し、15 cm シャーレの懸濁液を注ぐ。氷の上の皿を配置、フタ、400 mJ cm-2穏やかな混合とそれぞれの露出サイクル間氷の上 2 分区切りで UV 架橋剤の 254 nm の紫外線にセルを 3 回を公開します。 50 mL のチューブにセルを転送し、4 ° C で 3 分間 3,000 × g で遠心分離によって細胞を収集上澄みを廃棄し、ペレットを維持します。注: セルを液体窒素で凍結し、-80 ° C で保存されているスナップインできます。 冷やして換散バッファー A の 4 mL の細胞を再懸濁します (LB、100 mm トリス-HCl、pH 7.5、500 mM LiCl、10 ミリメートルの EDTA、1% トリトン X-100, 5 mM DTT、20 U ml-1プロテアーゼ阻害剤カクテルの無料の EDTA を完了私は、100 U ml-1 RNasin、DNase)。 2 つの 2 mL チューブにセルを転送します。Max を追加します。2/3 量ガラスビーズを冷やして、30 Hz で 4 ° C で 10 分間の組織 lyser のセルを破壊 熱い針をチューブの底に穴を開けるし、30 600 × g で遠心分離により、新鮮な 1.5 mL チューブにライセート転送 s。 4 ° C、3 分間 3,000 × g で 3 連続遠心によって溶解し、5,000 × g と 10,000 × g 5 分でクリアします。注: 抽出液体窒素でスナップ凍結でき-80 ° C で保存 線虫 c. エレガンス マツ材線虫病成長媒体 (NGM) 板 (0.3% 食塩水、1.7% 寒天、0.25% ペプトン、1 ミリメートル CaCl2、5 μ G/ml コレステロール、1 mM MgSO4、25 mM KPO4バッファー、pH 6.0)エシェリヒア属大腸菌OP50 ひずみとシードに 20 ° c 文化ブリストル N2 ワーム41. ワームを再懸濁します 15 mL チューブにワームを転送するプレートを振る、各プレートに M9 バッファー41 (0.3% KH2PO40.6% Na2HPO4、0.5% 食塩水、1 mM MgSO4) 5 mL を追加します。スライド内の懸濁液 2 μ L を置き、顕微鏡を用いた懸濁液でワームをカウントします。ワームあたり板の数を計算する係数を適用します。 収集 〜 (400 × g、2 分、RT) 室温で遠心分離によって 120,000 のワーム、上澄みを廃棄します。 ワームを 3 回洗浄します。したがって、M9 バッファーの 10 mL を追加し、インバージョンによるミックス、右で 2 分間 400 × g で遠心分離してワームを収集 ワームに 15 mL の M9 バッファーを追加し、室温 15 分間回転ホイール上に配置 NGM プレート (プレートあたり4,000 〜 ワーム) にワームを転送し、UV ライトに公開 (254 nm) 300 mJ cm-2 UV 架橋剤で。 プレートに直接 5 mL の M9 バッファーを追加し、バッファーでワームを再懸濁しますにプレートを振る。15 mL チューブにピペットの懸濁液を転送し、右で 2 分間 400 × g で遠心分離してワームを収集 2 mL の溶解バッファー B でワームを再懸濁します (LB B; 100 mM トリス-HCl、pH 8.0、150 mM の NaCl、1 mM EDTA、0.75 %1 mM DTT、20 U mL-1 DNase EDTA フリー プロテアーゼ阻害剤のカクテルを完了私は、100 U mL-1 RNasin、IGEPAL)。 液体窒素を充填モルタルでワームを挽きます。50 mL のチューブおよび室温解凍で粉を収集します。注: 液体窒素は安全プロシージャ (例えば、ヒューム フード ・安全手袋) に従って処理する必要があります。 10 分 14,000 × g で遠心分離によって脂肪層を含むライセートをオフにし、明らかに渡すその後注射器で 0.45 μ m のフィルターを通してライセート。 ひと培養細胞注: 以下の説明は pGL3 CDKN1B 3 HEK293 細胞のトランスフェクションに基づいて ‘ UTR 記者プラスミドのホタルのルシフェラーゼ遺伝子42の下流 CDKN1B/27 3′UTR を表す。 HEK293 細胞でダルベッコ変更されたワシの媒体 (DMEM) 25 mM グルコースと 1 mM ピルビン酸ナトリウムを含む 100 U mL-1ペニシリン, 100 μ g mL-1ストレプトマイシン, 10% 牛胎児血清 (FBS) を添加した、37 ° c で孵化させなさい、加湿チャンバー (インキュベーター) 5% CO2を含みます。 ~ 3 種 × 106 HEK293 細胞の標準的な 10 cm の組織培養皿、トランスフェクション前日です。診断とセルをカウントします。 レポーターの遺伝子のミックス 2 μ g (e.g。 pGL3 p27 3 ‘ UTR) トランスフェクション試薬の 20 μ l で transfect 70% の confluency (〜 7 × 106細胞) の細胞と。 さらに 48 時間 37 ° C でインキュベーターで収穫前にセルを配置します。 血清ピペットで培地を取り除き、37 ° C に加温した PBS の 10 mL で 2 回洗浄を迅速に血清ピペットと PBS を削除します。 皿に 6 mL の PBS を追加、氷の上に配置し、紫外線に細胞を公開 (254 nm) 100 mJ cm-2 UV 架橋ので。注: プレートは紫外線露光中に氷で保たれなければなりません。 PBS で 15 mL チューブへの転送 (合計 10 〜7細胞) の細胞をこすり落とします。 4 ° C で 10 分間 250 × g で細胞をスピン、ピペットで上澄みを取り外します。注: 細胞ペレットできますスナップ液体窒素で凍結、使用するまで-80 ° C で保存します。 あらかじめ冷やして換散バッファーの 2 mL の細胞を再懸濁します (LB-A) の上下にピペットで 5-6 回、氷の上の管を維持しながら。 氷上に置いた 5 mL 管にピペットでライセートを転送します。 対象 30 と 10 μ m の振幅で 20 s バーストから成る超音波照射の 3 つのラウンドにライセート氷上期間を冷却の s。注: 細胞と DNA のフラグメントの溶解が完了すると、超音波がお勧めします。 2 mL の管および 15,000 × g で 4 ° C で 10 分間遠心にライセートを転送します。上澄み (= エキス) を集め、新しい管へ転送。さらに蛋白質および RNA の解析のための分析サンプル (5-10%) を削除します。注: この手順は、任意の残りの細胞の残骸を削除する非常に重要ですし、繰り返すことができます。 3. 最初のステップ: 多 RNA 分離 ランダムプライマー25の 1 mg を平衡-それぞれの換散バッファーの 500 μ L の磁気ビーズを結合します。 ランダムプライマー25 mg の 1 それぞれ、5 mg、10 mg、4 mg (タンパク質)酵母、線虫HEK293 エキスを組み合わせる-磁気ビーズを結合します。積極的にミキサーで 25 ° C で 10 分間のサンプルをミックスします。注: 抽出液のタンパク質濃度は、参照標準としてウシ血清アルブミン (BSA) を使用してブラッドフォードの試金で決定できます。サンプルの活発な動揺は、ビーズの沈降を防ぎます。MRNA の分離の特異性を評価するには、polyadenylic 酸 (pA) の超過分 (20 μ g) を追加することによって、並列制御実験を実行できます。 10 s および削除、マグネット スタンドにチューブを置き、上澄み。氷回復 (ステップ 3.7) の後のラウンドの上清をしてください。 500 μ L の洗浄バッファー A に追加 (10 mM トリス-HCl、pH 7.5、600 mM LiCl、1 mM EDTA、0.1% トリトン X-100) ビーズと 5 の渦に s。メモ: 濃度 LiCl の洗浄バッファーが異なることができます。600 mM LiCl を推奨しますが、低濃度また (500 mM の線虫、HEK293 300 mM)、テストされました。 磁石でビーズを収集し、洗浄バッファー B (WB; 10 mM トリス-HCl、pH 7.5、600 mM LiCl、1 mM EDTA) 500 μ で二回ビーズを洗浄します。 ミキサーで 10 mm トリス-HCl、pH 7.5 連続振動 (1,000 rpm) と 2 分のための 80 ° C で 30 μ L の RNA を溶出します。すぐにマグネット スタンドにチューブを置き、10 後の溶出液を回収米保存浄化の追加ラウンド ビーズ。注: は、低い温度でビーズに Mrna の潜在的な再バインドの防止にできるだけ早く溶出液を収集します。 3.3 のステップで収集した上清を前の手順からビーズを追加し、キャプチャ、洗濯および溶出 Mrna の 2 回 (ステップ 3.3 3.6) を繰り返します。繰り返しラウンドから溶出し、結合され、-80 ° C で保存することができます。 4. 第 2 ステップ: 3′-ビオチン化 2’-メトキシ変性アンチセンス RNA オリゴヌクレオチドと特定のキャプチャの Mrna 注: ASOs の適合性をテストするには、次の手順は細胞から分離された総 Rna を実行できます。 バインドの 1 mL にストレプトアビジン結合磁性体ビーズ 30 μ L を平衡させ、洗浄バッファー (B & W バッファー; 10 mM トリス-HCl、pH 7.5、150 mM の NaCl、0.5 ミリメートルの EDTA、pH 8.0) で回転させ 1 時間で 0.1 mg mL-1大腸菌トランスファー RNA (tRNA) を含むRT。 B & W バッファーの 750 μ L にビードを 3 回洗浄しなさい。 B & W バッファーの 30 μ L のビードを再停止しなさい、使用するまで氷の上を保ちます。 希釈前の多分離から総蛋白質の ~ 35 μ g (3 参照) 1.5 mL チューブにバッファーが B & W の 100 μ L に。注: 総 RNA の ASOs の特異性をテストするには、追加 600 B & W バッファーの 100 μ L に浄化された総 RNA の ng。 それぞれの麻生の 200 pmol を追加し、70 の ° c で 5 分間インキュベートします。注意: 高温は、麻生の焼鈍を促進する RNA の二次構造を解決します。 デバイスから熱ブロック全体を削除し、常温でゆっくりとクールダウン 10 分置きます。 手順 4.1 から平衡ストレプトアビジン結合磁性体ビーズ 30 μ L をサンプルに追加します。 ミキサーで 950 rpm で一定の揺れと 25 ° C で 30 分のための混合物を孵化させなさい。注: ビーズの沈降を防ぐために管の 10 分毎をフリックすることをお勧めします。 マグネット スタンドにチューブを置き、上澄みを除去し、55 ° C で予め温めておいた B & W バッファーの 750 μ L にビードを 3 回洗浄しなさい注: 最適な洗浄温度若干異なる/異なります異なる ASOs の間。細胞抽出液を用いた実験を行う非架橋総 RNA 前とこの条件を調整することをお勧めします。 10 mm トリス-HCl、pH 7.5 ミキサー.で 950 rpm で一定の揺れと 10 分のための 90 ° C で 20 μ L の RNA を溶出します。マグネット スタンドにチューブを置き、すぐに溶出液を収集します。注: タンパク質解析ビーズに 1 × 塩化物イオンとバッファーの 20 μ L を追加し、5 分タンパク質は標準的な実験室のプロトコルのイムノブロット解析によって監視されるため、95 ° C で孵化させなさい。