Un tandem RNA isolation (TRIP) pour la récupération des complexes protéine-ARNm endogène formé décrit. Plus précisément, complexes ARN-protéine sont réticulés en vivo, polyadénylé RNAs sont isolés des extraits avec oligo (décollement) perles et ARNm particulier est capturés avec des oligonucléotides antisens RNA mis à jour le. Protéines liés à l’ARNm sont détectés par l’analyse par immunotransfert.
Protéines de liaison à l’ARN (pratiques commerciales restrictives) jouent un rôle clé dans le contrôle post-transcriptionnelle de l’expression génique. Caractérisation biochimique des complexes protéine-ADN messagère est donc essentielle pour comprendre le règlement ARNm déduite en protéines qui interagissent ou ARN non codants. Ici, nous décrivons une procédure d’isolement de RNA de tandem (voyage) qui permet la purification des complexes de protéine ARNm endogène formé d’extraits cellulaires. Le protocole en deux étapes consiste à isoler des polyadénylé ARNm avec perles antisens oligo (décollement) et suivantes de capture d’un ARNm d’intérêt avec 3′-biotinylé 2′-O-méthylé RNA oligonucléotides antisens, qui peut ensuite être isolé avec perles de streptavidine. VOYAGE a été utilisé pour récupérer in vivo des complexes mRNA-ribonucléoprotéine (mRNP) réticulé de levure, les nématodes et les cellules humaines pour une analyse ultérieure ARN et des protéines. Ainsi, le voyage est une approche souple qui peut être adaptée à tous types de polyadénylé RNAs à travers les organismes pour étudier la réorganisation dynamique de RNPm imposées par des signaux intracellulaires ou environnementales.
Régulation des gènes post-transcriptionnels est conduite à travers les interactions entre les protéines de liaison à l’ARN (pratiques commerciales restrictives), ARN (ncRNA) non codantes et ARNm, qui diriger le traitement, la localisation, la traduction et la décomposition de chaque relevé de notes au sein de cellules1 , 2. l’identification des pratiques commerciales restrictives et ARNnc interagissant avec les ARNm particuliers, établir ce qu’on appelle des complexes/particules ribonucléoprotéiques (RNP), est donc essentielle pour comprendre le sort des ARNm et gène contrôle d’expression. Approches complémentaires sont menées pour la caractérisation biochimique de la RNP complexes3,4: alors que l’approche « centrée sur les protéines » repose sur la purification des pratiques commerciales restrictives spécifiques, l’approche « RNA-centrique » implique la isolement des sous-populations ou RNAs individuels et l’analyse ultérieure des protéines qui interagissent ou ARN. Récemment, une approche axée sur les RNA d’identification du répertoire RBP interagissant avec polyadénylé (poly(A)) ARN5 est devenu plus en plus populaire en y incorporant une étape de réticulation lumière ultraviolette (UV) pour stabiliser la protéine-ARN avant les interactions l’isolement des ARNm, ce qui a considérablement élargi le catalogue des pratiques commerciales restrictives dans les cellules humaines6,7,8,9,10,11, Caenorhabditis elegans 12, saccharomyces cerevisiae12,13,14et autres organismes15,16,17,18, 19,20. Cependant, la cartographie des protéines et/ou ncRNA montés sur des transcriptions particulières est toujours un grand défi. À cette fin, deux approches principales sont actuellement utilisés : d’une part, RNA aptamère tags sont fusionnés à l’ARN d’intérêt pour permettre la purification d’affinité. Ainsi, les RNA aptamères lient avec une forte affinité aux aminosides, y compris la tobramycine et la streptomycine21,22,23,24, ou aux protéines, telles que la protéine de capside de la R17/MS2 phage ou bactériens streptavidine S125,26,27,28,29. Bien que cette approche s’est avérée relativement robuste et polyvalent, il exige le clonage à des fins de conception l’ARN sous enquête et donc ne peut servir à capturer des mRNAs naturel. En revanche, oligonucléotides antisens (ASOs) ont été utilisés très tôt pour la récupération et la caractérisation de fortement exprimée native RNP30,31 et l’ARN viral32. Plus récemment, ASOs ont été appliqués pour capturer longtemps non codant RNAs33,34,35 et en vitro formé RNPm36. Un des principaux facteurs limitants avec toutes les approches centrées sur le RNA sont le nombre de copies de l’ARN d’intérêt, ce qui rend la récupération des ARNm basse exprimée plus problématique. Cette limitation peut être surmontée en upscaling de la réaction ; Toutefois, cela peut conduire potentiellement à l’augmentation de l’arrière-plan.
Ici, nous décrivons notre tandem de ASO-basé récemment mise au point technique d’isolation RNA (TRIP) pour isoler des complexes protéine-ADN messagère native avec haute sélectivité37 (Figure 1). Le protocole comprend deux étapes de purification séquentielle de ASO-basé, à savoir l’isolement des ARNm poly avec oligo (décollement) disponibles dans le commerce couplé perles suivies de capture d’ARNm spécifiques utilisant spécifiquement conçu biotinylé court 2′ méthoxy- RNA ASOs. Cette procédure en deux étapes aide à éliminer les protéines contaminantes et ajoute des possibilités de réglage et optimisation. Dans ce cas, voyage a été appliquée sur certains ARNm de levure, nématodes, et confirmer in vivo des cellules humaines forment des complexes de protéine-ADN messagère.
VOYAGE permet l’analyse des protéines lié à l’ARNm spécifiques in vivo avec des moyens biochimiques. Alors que nous avons utilisé la méthode pour valider l’interaction des pratiques commerciales restrictives particuliers avec cibles ARNm de différents organismes/cellules, voyage pourrait également s’appliquer à étudier d’autres types de poly RNAs, tels que ncRNA long cytoplasmique. En outre, une analyse systématique des protéines liés et/ou RNAs avec MS ou ARN séquençage pourrait être atteint par un élargissement de la procédure. À cet égard, nos données préliminaires indiquent que 1 L de cultures de levure et au moins 100 millions de cellules HEK293 humaines pourraient fournir matière suffisante pour obtenir des données fiables de MS pour bien exprimée ARNm (résultats non publiés).
Le protocole décrit de voyage inclut l’irradiation des cellules avec la lumière UV à 254 nm aux interactions crosslink ARN-protéine. Cela permet la mise en oeuvre des conditions de lavage rigoureux au cours de la purification. Néanmoins, bien que non explicitement testés, nous tenons à noter que la réticulation est facultative et RNP actif peut aussi être récupérée avec tampons physiologiques. Toutefois, dans ce cas, le réaménagement potentiel des protéines et ARN sur l’ARN cible dans les lysats devrait être tenu compte. À l’inverse, si les UV ou autres procédures de réticulation sont appliquées (p. ex., formaldéhyde), l’intégrité de l’ARN doit être évaluée comme la dégradation de l’ARN pourrait conduire à la diminution de récupération de RNPm. En outre, UV-réticulation est plutôt inefficace (~ 5 %) et encore moins pour les protéines interagissent avec l’ARN bicaténaire, qui pourrait introduire un biais pour la détection de certaines classes de pratiques commerciales restrictives12. Enfin, irradiation aux rayons UV peut induire également des liaisons protéine-protéine et protéine-ADN qui devraient être considérés pour l’interprétation de données45,46. Par conséquent, procédures de réticulation alternatifs, par exemple avec le formaldéhyde, pourraient également être d’un intérêt particulier pour capturer de grandes assemblées de protéine sur l’ARNm.
Une caractéristique clée de voyage est en deux étapes procédure de purification ASO-basé pour récupérer RNAs particuliers, augmentant ainsi la sélectivité et diminue la probabilité de purification des contaminants. Par exemple, une préoccupation concerne ajoutant biotinylé ASOs directement aux extraits cellulaires, ce qui pourraient conduire à co purification des protéines liant la biotine. Pour éviter ce problème en voyage en mettant en place un premier cycle de purification d’ARN poly (a) à l’aide de covalence couplés oligo-(dT)25 billes magnétiques, qui permet à des conditions strictes de purification comme pour capture interactome ARN-protéine. En outre, sélection de RNA poly (a) supprime ncRNA très abondante, comme l’ARN ribosomal et ARNt et donc réduit la complexité de l’échantillon et les sources potentielles d’hybridation croisée et contamination. Dans la deuxième étape, ARNm particulier est récupérés avec biotinylé et modifiés ASOs qui recuisent avec les régions sur les objectifs de l’ARNm. Alternativement, ASOs mis à jour le pourraient également être directement de façon covalente à billes magnétiques par une amine-linker, réduire la propension à capturer des protéines de liaison de biotine. Toutefois, selon notre expérience, l’incubation de la fraction d’ARN poly (a) avec ASOs avant l’ajout de perles de streptavidine récupéré RNPm plus efficacement que l’addition directe d’ASO-couplé de perles. Éventuellement, oligos libres sont cinétiquement favorisés un meilleur accès aux séquences dans l’ARN structurée par rapport aux oligos immobilisée. Par conséquent, le couplage covalent de ASOs à perles avant l’incubation avec l’échantillon pourrait être préjudiciable pour la récupération de la cible de RNA et doit être testées empiriquement.
Un inconvénient avec les méthodes ASO basé est inefficace récupération de certains ARNm cible. Nous recommandons donc l’évaluation de plusieurs ASOs qui recuire dans différentes régions de la transcription. Plus précisément, nous proposons la conception de 2-3 ASOs qui recuisent avec des séquences dans la 3′-UTR ou les CDS de l’ARNm d’intérêt. Chaque ASO peuvent montrer une efficacité différente pour le recouvrement de la cible de mRNA respectifs et devraient être empiriquement testé (Figure 2 a, B, données non présentées). À la fin, nous avons constaté que ASOs recuit à la 3′ UTR performants par rapport à celles recuit sur CD. Cela pourrait être dû à une plus grande accessibilité des sites de liaison à RTNS en raison de l’absence de traduction des ribosomes, tandis que les ribosomes peuvent gêner l’hybridation efficace au sein de la CD. Nous avons aussi connu que la combinaison de plusieurs ASOs pourrait conduire à une contamination accrue d’abondants non cibles ARNm et réduit l’efficacité du menu déroulant. Dans tous les cas, la sélectivité de l’oligos choisie peut être contrôlée par des expériences de compétition (e.g., ajout d’oligos concurrentes).
Une autre préoccupation est celle de l’hybridation croisée potentielle avec ARN non apparentés, comme nous avons observé cette hybridation même partielle avec autres ARNm peut conduire à la récupération de cet ARNm (Figure 2). Pour évaluer l’adéquation de l’ASOs conçus, nous recommandons donc de procéder initiale in vitro test avec ARN total afin d’optimiser les concentrations de sels et de la température de lavage de tampons. Dans nos mains, lavage de streptavidine couplé des billes magnétiques dans des tampons contenant 150 mM NaCl à 55 ° C exécuté mieux, mais nous recommandons des tests indépendants des conditions pour chaque ASO conçu. Remarquable, nous ont trouvé de que ASOs tous choisis parmi les expériences in vitro (Figure 2D) appropriés pour capturer les cibles ARNm respectifs d’extraits cellulaires de réticulé (Figure 3), plus justifiant la validité des en vitro tests. Outre la conception ASOs appropriées pour la capture de l’ARNm, facteurs additionnels pourraient avoir une incidence sur la sélectivité. Par conséquent, des procédures détaillées blocage avec BSA et/ou tRNA selon les spécifications de type perle peuvent empêcher liaison non-spécifique à perles. Pour réduire l’absorption non spécifique des protéines, nous recommandons également l’utilisation de tubes de Lo-lier, en particulier lorsque vous travaillez avec de faibles quantités d’échantillons.
En général, voyage peut venir en complément des approches précédemment établies pour capturer RNAs avec ASOs. Par exemple, le RNA de non-codage Xist a été isolé avec des protéines dépendant des extraits nucléaires issus de 200 millions UV réticulé cellules en utilisant un tableau de long (90-mer) biotinylé oligonucléotides d’ADN qui recouvrait la transcription complète 34,,35. Toutefois, l’approche choisie carrelage pourrait devenir problématique compte tenu le fort potentiel d’hybridation croisée avec ARN non apparentés, et il ne peut pas être utilisé pour sélectionner transcription spécifique, par exemple., alternativement épissé formes. Récemment, spécialement l’acide nucléique verrouillé (LNA) ou ADN ASO mixmers ont été de façon covalente à une résine magnétique pour récupérer in vitro de transcription ou hautement exprimé ribosomal RNA d’extraits cellulaires ; Cependant, il n’a pas été testé pour la récupération in vivo formé ARNm en protéines complexes36. À la lumière de la reconnaissance accrue du contrôle post-transcriptional gene par les pratiques commerciales restrictives et ARNnc, nous croyons que le voyage est une méthode utile pour étudier la composition et la dynamique de complexes de RNP dans les cellules des signaux intracellulaires et environnementales et son impact dans la santé et la maladie.
The authors have nothing to disclose.
Nous sommes reconnaissants à m. Jonathan Hall et Mauro Zimmermann (ETH Zurich) pour la synthèse de PFK2 et cep-1 ASOs, Dr Maikel Wouters pour la conception de ASOs p27/CDKN1B et Dr Rafal Ciosk (Friedrich Miescher Institute for Biomedical Research, Basel) d’anticorps anti-GLD-1. Ce travail a été soutenu par la biotechnologie et Biological Sciences Research Council (BB/K009303/1) et un Royal Society Wolfson Research prix du mérite (WM170036) à A.P.G.
MaxQ 5000 Large Incubated and Refrigerated Orbital Shaker | Thermo Fisher Scientific | SHKE5000-8CE | Floor shaker to grow yeast cells |
BBD 6220 | Thermo Fisher Scientific | CO2 incubator to grow human cells | |
Sonicator Soniprep150 | MSE | MSS150.CX4.5 | Sonicator/cell disruptor. Used to shear DNA in human cell lysates |
Stratalinker 1800 | Stratagene | Stratalinker to expose cells to UV light at 254 nm | |
Tissue Lyser | Qiagen | RETSCH MM200 | Device to mechanically disrupt yeast cells |
Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5810R | Centrifuge to spin down cells, lysates |
Shaking incubator, Thriller | Peqlab | Thermoshaker for 1.5 mL tubes | |
Glass beads 0.5mm | Stratech Scientific Limited | 11079105 | Lysis of yeast cells |
Nylon Filter, 0.41 μm | Millipore | NY4104700 | Collection of yeast cells |
Millex-HA Filter, 0.45 µm | EMD Millipore | SLHA02510 | Filter to clear nematode lysate |
Eppendorf LoBind microcentrifuge tubes Protein 1.5 mL | Sigma-Aldrich | 22431081 | Minimise protein loss |
2 mL microfuge tube | Ambion | AM12425 | Yeast extract preparation and other applications |
5 mL tube | Thermo Fisher Scientific | 129A | Collection of HEK293 cell lysate |
15 mL tube | Sarstedt | 62.547.254 | Collection C. elegans |
50 mL plastic tube | Sarstedt | 62.554.502 | Collection yeast cells |
DMEM, high glucose, pyruvate | Thermo Fisher Scientific | 41966 | Media for culturing HEK293 cells |
Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | Used to supplement cell culture media to control bacterial contamination |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | Used to supplement cell culture media |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668027 | Transfection reagent |
RQ1 RNase-Free DNase | Promega | M6101 | DNAse I to degrade DNA from cell lysate |
RNasin Plus RNase Inhibitor | Promega | N2611 | RNase inhibitor to avoid RNA degradation |
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | Protease inhibitor cocktail to avoid protein degradation |
Dynabeads Oligo (dT)25 | Thermo Fisher Scientific | 61011 | Magnetic beads required for the first step of mRNA-protein complex purification |
Dynabeads M-280 Streptavidin | Thermo Fisher Scientific | 11205D | Magnetic beads required for the second step of mRNA-protein complex purification |
E. coli tRNA | Sigma-Aldrich | 10109550001 | transfer RNA from E. coli used for blocking streptavidin beads and avoid unsepecific interactions |
Quick Start Bradford 1x Dye Reagent | BioRad | 5000205 | To determine protein concentration within lysates, using BSA as reference |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A7906-100G | Used to perform the standard curve that will be used as reference for protein concentration determination |
mouse anti-Act1 | MP Biomedicals | 869100 | Antibody for detection of yeast actin in Western blot (1:2,500) |
mouse anti-Act1 | Sigma | A1978 | Antibody for detection of human actin in Western blot (1:2,000) |
mouse anti-HuR | Santa Cruz | sc-5261 | Antibody for detection of HuR in Western blot (1:500) |
mouse anti–CYC-1 | Invitrogen | 456100 | Antibody for detection of Cyc-1 in Western blot (1:1,000) |
peroxidase anti-peroxidase soluble complex | Sigma | P1291 | Detection of Pfk2:TAP in Western blot (1:5,000) |
HRP-conjugated sheep anti-mouse IgG | Amersham | NXA931 | HRP-coupled secondary antibody |