Адгезию динамической Assay для функционального анализа антиадгезионное терапии в воспалительных заболеваний кишечника
概要
Динамический адгезии иммунокомпетентных клеток к стенке сосуда является необходимым условием для кишечника самонаведения. Здесь мы представляем протокол для функциональной в vitro пробирного анализа воздействия антител анти Интегрин, chemokines или других факторов на динамических клеточной адгезии клеток человека с помощью addressin покрытием капилляров.
Abstract
Гут самонаведения иммунных клеток имеет важное значение для патогенезе воспалительных заболеваниях кишечника (IBD). Интегрин зависимой клеточной адгезии к addressins является важным шагом в этом процессе и терапевтические стратегии, мешая адгезии были успешно установлены. Интегрин антитела анти α4β7, vedolizumab, используется для клинического лечения болезни Крона (CD) и язвенного колита (UC) и дальнейшего соединения могут последовать.
Детали сцепления процедуры и механизмы действия антител анти Интегрин во многих отношениях из-за ограниченных имеющихся методов для функциональных исследований в этой области по-прежнему неясны.
Здесь мы представляем динамического адгезии assay для функционального анализа адгезии клеток человека условиях потока и влияние анти Интегрин терапии в контексте IBD. Он основан на перфузии первичных клеток человека через капилляры addressin покрытием ультратонких стекла с микроскопический анализ в реальном времени. Assay предлагает разнообразные возможности для уточнения и изменения и проводит потенциалов для механистический открытий и трансляционная приложений.
Introduction
Ячейки движения жестко регулируется процесс незаменимым для развития и функционирования многоклеточных организмов, но также замешан в патогенезе множества заболеваний1. Недавно процесс самонаведения иммунных клеток из крови в периферических тканях приобрел все большее внимание, так как он способствует пополнения и расширения болезнетворные клетки в воспаленных тканях иммунологически опосредованной заболеваний2 ,3. В частности было показано самонаведения иметь трансляционная отношение при воспалительных заболеваниях кишечника (IBD). Vedolizumab антитела Интегрин терапевтического анти α4β7, вмешиваясь в кишечнике самонаведения показал эффективность в крупных клинических испытаний в4,5 и успешно используется в реальной клинической практике6,7 , 8. дальнейшие соединения могут последовать9,10. Аналогично антитела Интегрин терапевтического анти α4, natalizumab, используется для лечения рассеянного склероза (РС)11.
Однако наши функциональные понимание самонаведения процесса в целом и механизм действия таких терапевтических антител в частности еще ограничено. Хорошо известно, что головка самонаведения состоит из нескольких этапов, включая клетки привязывать и прокатки с последующим клеточной адгезии, ведущих к фирмы арест последовал транс эндотелиальной миграции12,13. Вышеупомянутые антитела нейтрализовать интегринов на поверхности клеток, предотвращая взаимодействие с addressins на эндотелий стенок сосудов. Это считается препятствуют фирмы клеток адгезии14,15. Тем не менее мы только начинаем понимать дифференциального актуальность конкретных интегринов для клеток самонаведения различных клеток подмножеств. Кроме того воздействие антител анти Интегрин на различных мобильных подмножеств и доза ответ ассоциаций в основном неизвестны, ведущих к много открытых вопросов в области кишечника самонаведения и антиадгезионное терапии в IBD.
Таким образом отчаянно необходимы удобные инструменты для решения таких вопросов. Эффект анти Интегрин антител на Интегрин addressin взаимодействие пока преимущественно была оценена оценки эффективности/привязки ингибирование привязки с проточной цитометрии или через статического прилипания анализов16,17 ,18,19,20, таким образом с очевидной упрощение и отклонение от физиологические ситуации. Мы недавно создали динамический адгезии пробирного учиться Интегрин зависимых адгезии клеток человека в addressins и последствия антител анти Интегрин под касательное напряжение2. Принцип метода ранее было продемонстрировано с мыши клетки21,22. Здесь он был адаптирован и разработаны для решения упомянутых выше вопросов, поступательные, открытие Роман способы лучше понять механизмы терапии с анти Интегрин антител в естественных условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Вышеупомянутый Протокол описывает полезный метод для изучения динамических адгезии иммунных клеток человека в эндотелиальных лигандами. Путем изменения покрытием лигандов, типы перфузии клеток или подмножества, инкубации с дополнительные стимулы или различных нейтрализующих антит…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Исследования CN, IA, НБН и SZ было поддержано междисциплинарный центр клинических исследований (IZKF) и ELAN программа Университета Эрланген-Нюрнберг, остальное Kröner-Fresenius-Stiftung, Фриц-Бендер-Stiftung, немецкий крона и Колит фонда (DCCV), клинических исследований группы CEDER немецкого совета научных исследований (DFG), программа тему DFG на микрофлору, новые поля инициативу и DFG совместных научно-исследовательских центров 643, 796 и 1181.
Materials
| 48-Well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 ml Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
参考文献
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration – Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn’s Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Binder, M. -. T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , (2018).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn’s disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
- Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice–a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
- Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
- Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), 135-144 (2017).
- Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
- Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
- Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
- Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), 1497-1505 (1997).
- Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -. L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
- Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
- Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
- Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
- Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
- Binder, M. -. T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
- Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
- House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
- Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).
