والرزن التصاق الديناميكي للتحليل الوظيفي من العلاجات المضادة الالتصاق في مرض التهاب الأمعاء
概要
التصاق دينامية للخلايا المناعية لجدار الوعاء شرطا لصاروخ موجه القناة الهضمية. نقدم هنا، بروتوكولا مقايسة وظيفية في المختبر لتحليل تأثير الأجسام المضادة-إنتغرين أو المستقطبات أو غيرها من العوامل على التصاق الخلية الحيوية للخلايا البشرية باستخدام الشعيرات الدموية المغلفة أدريسين.
Abstract
صاروخ موجه القناة الهضمية للخلايا المناعية مهم للآلية المرضية لأمراض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين). التصاق الخلية إنتغرين-تعتمد على أن أدريسينس خطوة حاسمة في هذه العملية، ووضعت استراتيجيات علاجية تتداخل مع الالتصاق بنجاح. جسم إنتغرين مكافحة–α4β7، فيدوليزوماب، ويستخدم للمعالجة السريرية لداء كرون (CD) والتهاب القولون التقرحي (UC) ومركبات أخرى من المحتمل أن تتبع.
تفاصيل الإجراء التصاق وآليات عمل الأجسام المضادة-إنتغرين لا تزال غير واضحة في ما يخص العديد من التقنيات المتاحة محدودة بسبب للبحوث الفنية في هذا المجال.
نقدم هنا، مقايسة التصاق ديناميكي للتحليل الوظيفي لالتصاق الخلايا البشرية تحت ظروف التدفق وأثر العلاجات المضادة-إنتغرين في إطار بنك التنمية بين الأمريكتين. أنه يستند إلى التروية للخلايا البشرية الأولية من خلال الشعيرات الدموية الزجاج سامسونج أدريسين المغلفة بالتحليل المجهري في الوقت الحقيقي. يقدم مجموعة متنوعة من الفرص المتاحة لإدخال تحسينات وتعديلات المقايسة ويحمل إمكانات للاكتشافات الميكانيكية وتطبيقات متعدية الجنسيات.
Introduction
الحركة خلية محكم تنظيم عملية لا غنى عنها للتنمية ووظيفة الكائنات الحية متعددة الخلايا، ولكن أيضا تورط في الآلية المرضية للعديد من الأمراض1. في الآونة الأخيرة، اكتسبت عملية استضافة أكثر من الخلايا المناعية من مجرى الدم إلى الأنسجة المحيطة اهتماما متزايداً، نظراً لأنها تسهم في تجديد وتوسيع نطاق من الخلايا المسببة للأمراض في أنسجة ملتهبة في وساطة مناعي الأمراض2 ،3. على وجه الخصوص، أظهرت صاروخ موجه إلى أهمية متعدية الجنسيات في أمراض التهاب الأمعاء (بنك التنمية بين الأمريكتين). فيدوليزوماب جسم إنتغرين العلاجية المضادة-α4β7 التدخل في توجيه القناة الهضمية وقد أظهرت فعاليتها في تجارب سريرية كبيرة4،5 وقد استخدمت بنجاح في العالم الحقيقي الممارسة السريرية6،7 , 8-مركبات أخرى من المحتمل أن تتبع9،10. وبالمثل، يستخدم جسم إنتغرين العلاجية المضادة-α4، ناتاليزوماب، لعلاج التصلب المتعدد (MS)11.
ومع ذلك، فهمنا الوظيفية العملية صاروخ موجه بصورة عامة وآلية العمل لهذه الأجسام المضادة العلاجية خاصة لا تزال محدودة. ومن الثابت أن صاروخ موجه تتألف من العديد من الخطوات بما في ذلك الربط الخلية والمتداول مع التصاق الخلايا اللاحقة أدت إلى توقيف شركة تليها عبر الهجرة غشائي12،13. تحييد الأجسام المضادة المشار إليها أعلاه إينتيجرينس على سطح الخلية منع التفاعل مع أدريسينس في البطانة جدار الوعاء الدموي. هذا ويعتقد أن تعيق التصاق الخلية الثابت14،15. حتى الآن، لقد بدأنا فقط لفهم أهمية التفاضلية إينتيجرينس محددة لصاروخ موجه من خلية لخلية متميزة مجموعات فرعية. وعلاوة على ذلك، خلية آثار الأجسام المضادة-إنتغرين على مختلف المجموعات الفرعية والجمعيات الاستجابة للجرعة معروفة إلى حد كبير مما أدى إلى الكثير من الأسئلة المفتوحة في مجال العلاجات صاروخ موجه والمضادة الالتصاق الغريزي في بنك التنمية بين الأمريكتين.
ولذلك، تمس الحاجة إليها أدوات ملائمة للتصدي لهذه المسائل. حتى الآن تم تقييم تأثير الأجسام المضادة-إنتغرين على التفاعل أدريسين إنتغرين أساسا بتقييم تثبيط فعالية/ملزمة ملزمة مع التدفق الخلوي أو عن طريق التصاق ثابتة فحوصات16،17 ،18،19،20، وبالتالي مع تبسيط الظاهر وانحراف عن الحالة الفسيولوجية. كما أنشأنا مؤخرا مقايسة التصاق دينامية لدراسة التصاق إنتغرين-تعتمد على الخلايا البشرية إلى أدريسينس والآثار للأجسام المضادة-إنتغرين تحت إجهاد القص2. وفي وقت سابق ثبت مبدأ هذه التقنية مع الماوس الخلايا21،22. هنا، كان تكييفها وتطويرها لمعالجة المسائل المذكورة أعلاه متعدية الجنسيات، وفتح مجالات جديدة لأفضل فهم آليات العلاج مع إنتغرين مكافحة الأجسام المضادة في الجسم الحي.
Protocol
Representative Results
Discussion
البروتوكول أعلاه توضح تقنية مفيدة لدراسة دينامية التصاق الخلايا المناعية البشرية إلى يغاندس بطانية. من خلال تباين يغاندس المغلفة، أنواع الخلايا perfused أو مجموعات فرعية، والحضانة مع محفزات إضافية أو الأجسام المضادة لتحييد مختلفة، فقد تقريبا التطبيقات المحتملة غير محدود. ولذلك، قد يكون من …
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيده البحث CN، IA، ومعاملة الدولة الأكثر رعاية وسهير مركز إينتيرديسسيبليناري للبحوث السريرية (إيزكف) والبرنامج الهمة من جامعة ارلنجن-نورمبرغ، فريتز-بندر-ستيفتونغ كرون الألمانية، آخر كرنر-فريسينيوس-ستيفتونغ و التهاب القولون مؤسسة (دككف)، “سدر مجموعة البحوث السريرية” للالماني البحوث مجلس (DFG)، البرنامج الموضوع DFG الحجمية و “المبادرة الميدانية المستجدة” و DFG التعاونية أبحاث مراكز 643، 796 و 1181.
Materials
| 48-Well plate | Sarstedt | 833,923 | |
| Adhesion buffer: 150mM NaCl + 1mM HEPES + 1mM MgCl2 + 1mM CaCl2 | |||
| Blocking solution: 1x PBS in ddH2O + 5 % BSA | |||
| Bovine Serum albumin (BSA) | Applichem | A1391,0100 | |
| CaCl2 | Merck | 2382 | |
| Capillaries: Rectangle Boro Tubing 0,20×2.00 mm ID, 50 mm length | CM Scientific | 3520-050 | |
| CCL-2, human | Immunotools | 11343384 | |
| CD4-Microbeads, human | Miltenyi Biotec | 130-045-101 | |
| CellTrace™ CFSE Cell Proliferation Kit | ThermoFischer Scientific | C34554 | |
| Centrifuge (Rotixa 50 RS) | Hettrich | ||
| Coating buffer: 150 mM NaCl + 1 mM HEPES | |||
| Confocal Microscope (TCS SP8) | Leica | ||
| CXCL-10, human | Immunotools | 11343884 | |
| Dextran 500 | Roth | 9219.3 | |
| EDTA KE/9 ml Monovette | Sarstedt | ||
| Falcons (50 mL) | Sarstedt | 62,547,004 | |
| Fc chimera isotype control | R&D Systems | 110-HG | |
| Flow Rates Peristaltic Pump (LabV1) | Baoding Shenchen Precision Pump Company | ||
| HEPES | VWR | J848-100ML | |
| Human IgG Isotype Control | ThermoFischer Scientific | 31154 | |
| Intercellular Adhesion Molecule 1 (ICAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 720-IC-050 | |
| LS-Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| MgCl2 | Roth | ||
| MnCl2 | Roth | ||
| mouse IgG isotype control | Miltenyi Biotec | 130-106-545 | |
| Mucosal Vascular Addressin Cell Adhesion Molecule 1 (MAdCAM-1) Fc chimera | R&D Systems | 6056-MC | |
| NaCl | Roth | 3957.3 | |
| Natalizumab | Biogen | ||
| Neubauer Counting chamber | Roth | T729.1 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-601000 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Biochrom | L 182-10 | w/o Mg and Ca |
| Plastic paraffin film: Parafilm (PM-996) | VWR | 52858-000 | |
| purified anti-human CD18 | Biolegend | 302102 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco Life Technologies | 61870-010 | |
| Rubber tubing: SC0059T 3-Stop LMT-55 Tubing, 1.02mm ID, 406.4 mm length | Ismatec | SC0059 | |
| Serological Pipetts | Sarstedt | 861,254,025 | |
| Trypan blue | Roth | CN76.1 | |
| Vascular Cell Adhesion Molecule 1 (VCAM-1) Fc chimera | Biolegend | 553706 | |
| Vedolizumab (Entyvio) | Takeda |
参考文献
- von Andrian, U. H., Mackay, C. R. T-Cell Function and Migration – Two Sides of the Same Coin. New England Journal of Medicine. 343 (14), 1020-1034 (2000).
- Zundler, S., et al. The α4β1 Homing Pathway Is Essential for Ileal Homing of Crohn’s Disease Effector T Cells In Vivo. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 379-391 (2017).
- Binder, M. -. T., et al. Similar inhibition of dynamic adhesion of lymphocytes from IBD patients to MAdCAM-1 by vedolizumab and etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. , (2018).
- Feagan, B. G., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for ulcerative colitis. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 699-710 (2013).
- Sandborn, W. J., et al. Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn’s disease. The New England Journal of Medicine. 369 (8), 711-721 (2013).
- Baumgart, D. C., Bokemeyer, B., Drabik, A., Stallmach, A., Schreiber, S. Vedolizumab Germany Consortium Vedolizumab induction therapy for inflammatory bowel disease in clinical practice–a nationwide consecutive German cohort study. Alimentary Pharmacology & Therapeutics. 43 (10), 1090-1102 (2016).
- Kopylov, U., et al. Efficacy and Safety of Vedolizumab for Induction of Remission in Inflammatory Bowel Disease-the Israeli Real-World Experience. Inflammatory Bowel Diseases. 23 (3), 404-408 (2017).
- Amiot, A., et al. Effectiveness and Safety of Vedolizumab Induction Therapy for Patients With Inflammatory Bowel Disease. Clinical Gastroenterology and Hepatology: The Official Clinical Practice Journal of the American Gastroenterological Association. 14 (11), 1593-1601 (2016).
- Vermeire, S., et al. Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial. Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).
- Vermeire, S., et al. Anti-MAdCAM antibody (PF-00547659) for ulcerative colitis (TURANDOT): a phase 2 randomised, double-blind, placebo-controlled trial. Lancet. 390 (10090), 135-144 (2017).
- Miller, D. H., et al. A Controlled Trial of Natalizumab for Relapsing Multiple Sclerosis. New England Journal of Medicine. 348 (1), 15-23 (2003).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nature Reviews. Immunology. 7 (9), 678-689 (2007).
- Ley, K., Rivera-Nieves, J., Sandborn, W. J., Shattil, S. Integrin-based therapeutics: biological basis, clinical use and new drugs. Nature Reviews. Drug Discovery. 15 (3), 173-183 (2016).
- Wyant, T., Yang, L., Fedyk, E. In vitro assessment of the effects of vedolizumab binding on peripheral blood lymphocytes. mAbs. 5 (6), 842-850 (2013).
- Fischer, A., et al. Differential effects of α4β7 and GPR15 on homing of effector and regulatory T cells from patients with UC to the inflamed gut in vivo. Gut. 65 (10), 1642-1664 (2016).
- Wyant, T., Estevam, J., Yang, L., Rosario, M. Development and validation of receptor occupancy pharmacodynamic assays used in the clinical development of the monoclonal antibody vedolizumab. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 90 (2), 168-176 (2016).
- Tidswell, M., et al. Structure-function analysis of the integrin beta 7 subunit: identification of domains involved in adhesion to MAdCAM-1. Journal of Immunology. 159 (3), 1497-1505 (1997).
- Soler, D., Chapman, T., Yang, L. -. L., Wyant, T., Egan, R., Fedyk, E. R. The Binding Specificity and Selective Antagonism of Vedolizumab, an Anti-α4β7 Integrin Therapeutic Antibody in Development for Inflammatory Bowel Diseases. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 330 (3), 864-875 (2009).
- Parikh, A., et al. Vedolizumab for the treatment of active ulcerative colitis: a randomized controlled phase 2 dose-ranging study. Inflammatory Bowel Diseases. 18 (8), 1470-1479 (2012).
- Wendt, E., White, G. E., Ferry, H., Huhn, M., Greaves, D. R., Keshav, S. Glucocorticoids Suppress CCR9-Mediated Chemotaxis, Calcium Flux, and Adhesion to MAdCAM-1 in Human T Cells. The Journal of Immunology. 196 (9), 3910-3919 (2016).
- Nussbaum, C., et al. Sphingosine-1-phosphate receptor 3 promotes leukocyte rolling by mobilizing endothelial P-selectin. Nature Communications. 6, (2015).
- Pruenster, M., et al. Extracellular MRP8/14 is a regulator of β2 integrin-dependent neutrophil slow rolling and adhesion. Nature Communications. 6, (2015).
- Binder, M. -. T., et al. Similar Inhibition of Dynamic Adhesion of Lymphocytes From IBD Patients to MAdCAM-1 by Vedolizumab and Etrolizumab-s. Inflammatory Bowel Diseases. 24 (6), 1237-1250 (2018).
- Wang, L., et al. Vessel Sampling and Blood Flow Velocity Distribution With Vessel Diameter for Characterizing the Human Bulbar Conjunctival Microvasculature. Eye & Contact Lens. 42 (2), 135-140 (2016).
- House, S. D., Johnson, P. C. Diameter and blood flow of skeletal muscle venules during local flow regulation. The American Journal of Physiology. 250 (5 Pt 2), H828-H837 (1986).
- Zundler, S., Neurath, M. F. Pathogenic T cell subsets in allergic and chronic inflammatory bowel disorders. Immunological Reviews. 278 (1), 263-276 (2017).
- Zundler, S., Becker, E., Weidinger, C., Siegmund, B. Anti-Adhesion Therapies in Inflammatory Bowel Disease-Molecular and Clinical Aspects. Frontiers in Immunology. 8, (2017).
- Zhou, Y., Kucik, D. F., Szalai, A. J., Edberg, J. C. Human Neutrophil Flow Chamber Adhesion Assay. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), (2014).
- Zundler, S., et al. Blockade of αEβ7 integrin suppresses accumulation of CD8(+) and Th9 lymphocytes from patients with IBD in the inflamed gut in vivo. Gut. 66 (11), 1936-1948 (2017).
