꿀벌에서 두뇌 Homogenate에서 Phospholipase C 활동의 탐지
概要
꿀벌 두뇌의 다른 지역에서 phospholipase C (PLC)에 pharmacologic 에이전트의 억제 효과 테스트 하려면 우리는 그 지역에서 PLC 활동을 측정 하는 생 화 확 적인 분석 결과 제시. 이 분석 결과 PLC 활동 조직 들 뿐만 아니라 다른 행동을 전시 하는 꿀벌 들을 비교 하는 데 유용 수 있습니다.
Abstract
꿀벌은 복잡 한 행동과 학습, 메모리, 및 분업 등 더 높은 두뇌 기능을 평가 하기 위한 모형 유기 체. 버섯 몸 (MB)은 복잡 한 꿀벌 행동의 신경 기질 수 제안 더 높은 두뇌 센터 이다. 이전 연구 유전자와 단백질을 차동는 MBs 및 다른 뇌 영역에 표시 됩니다 확인, 각 지역에 있는 단백질의 활동은 아직 완전히 이해 되지. 두뇌에 있는이 단백질의 기능을 공개, 약리학 적인 분석 가능한 접근 이지만 약리학 적인 조작 사실 이러한 두뇌 지구에서 단백질 활동 변경 확인을 첫 번째 필요.
우리는 이전 phospholipase C (PLC) 다른 두뇌 지역에 보다 MBs에 인코딩 하는 유전자의 높은 식 식별 하 고 약리학 꿀벌 행동에 PLC의 참여 평가. 그 연구에서 우리는 화학적 두 pharmacologic 에이전트를 테스트 하 고 그들은 PLC는 MBs 및 다른 뇌 영역에서 활동 감소 확인. 여기, 우리는 꿀벌 뇌 homogenate에서 PLC 활동을 검출 하는 방법에 대 한 자세한 설명을 제시. 이 분석 결과 시스템에서 homogenates 서로 다른 뇌 영역에서 파생 된 합성 fluorogenic 기판으로 반응 하 고 PLC 활동에서 발생 하는 형광은 계량 두뇌 지구 사이 비교. 우리는 또한 동일한 시스템을 사용 하 여 PLC 활동에 특정 약물의 억제 효과의 평가 설명 합니다. 이 시스템은 다른 생 형광 화합물 및 분석 결과 구성 요소와 조직의 흡 광도 의해 영향을 가능성이 높습니다, 하지만이 시스템을 사용 하 여 PLC 활동의 측정은 안전 하 고 전통적인 분석 결과 사용 하 여 보다 쉽게는 방사선된 기판을 필요합니다. 간단한 절차와 조작 PLC 활동 두뇌와 다른 사회적 작업에 관련 된 꿀벌의 다른 조직에서 검사 수 있습니다.
Introduction
유럽 꿀벌 (Apis mellifera L.)는 eusocial 곤충, 그리고 여성 꿀벌 표시 노동의 연령에 따라과 계급 종속 복제. 예를 들어 ‘노동자’ 라고 하는 꿀벌의 메 마른 계급, 젊은 개인이 오래 된 것 들 꼴 꿀 및 꽃가루 하이브1밖에 서 하는 동안이 broods 피드. 학습 및 메모리 채집 반복적으로 음식 소스와 그들의 둥지 사이 앞뒤로 이동 해야 합니다 때문에 좋은 음식 소스 춤을 통해 그들의 nestmates의 위치를 의사 소통 능력은, 꿀벌의 삶에 매우 중요 하다 통신1. 이전 학문 설명 MB, 곤충에 더 높은 두뇌 센터는 꿀벌2,,34의 학습 및 기억 능력에 관여 했다. 차동 표현한 유전자와 단백질 꿀벌5,6,7,8,,910 의 다양 한 두뇌 지역에서 발견 되었습니다. 11, 각 뇌 영역의 독특한 기능 관련 제안. 약리학 적인 억제 또는 관심사의 단백질의 활성화는 꿀벌 행동12,,1314에 단백질의 기능을 잘 사용된 접근, 그것은 알 모든 약물 여부 꿀벌 두뇌의 다른 지역에서 기능적 효과 있다. 같은 약물의 기능 유효성 검사 행동 약리학의 연구에서 결론을 강화 것입니다.
여기, 우리는 PLC, 마우스 인식15,,1617,18에 연루 효소 중 하나에 집중 한다. PLC는 칼슘을 이노 시 톨 1,4,5-trisphosphate (IP3) 및 diacylglycerol (DAG)19,,2021에 phosphatidylinositol 4, 5 bisphosphate (핍2)를 저하 하 여 신호를 트리거합니다. IP3 IP3 수용 체 (ER), 바인딩과 그물에 응급실에서 칼슘 이온의 출시로 이어지는 열립니다. 나온된 칼슘 calmodulin와 칼슘 calmodulin 인당 단백질 키 니 아 II (CaMKII)와 단백질 키 니 아 제 C (PKC) DAG의 존재를 활성화합니다. 두 단백질 kinases는 학습 및 메모리22,23,이 과정에서 PLC의 참여와 참여. Plc는 하위 유형, PLCβ, PLCγ, PLCε,20그들의 구조 따라 등으로 분류 됩니다. 각 PLC 하위 컨텍스트20에서 활성화 되 고 그 하위 인코딩 유전자 차동 다른 조직에 표현 됩니다. 우리는 이전 증명 꿀벌 MBs 유전자는 나머지 뇌 영역24, 보다 높은 수준에서 PLCβ 및 PLCε 하위 인코딩 익스프레스 고 두 팬 PLC 억제제 (edelfosine, 네오 마이 신 황산 [네오 마이 신])에서 PLC 활동 감소 다른 지역 두뇌와, 참으로, 꿀벌24의 학습 및 기억 능력에 영향을 미칠.
전통적으로, PLC의 효소 활동 방사선된 핍225, 적절 한 훈련, 장비 및 시설 필요를 사용 하 여 측정 되었습니다 했다. 최근, PLC의 합성 fluorogenic 기판 설립된26, 표준 실험실에서 PLC 활동을 평가 하기 쉽게 되었습니다. 여기, 우리 fluorogenic 기판을 사용 하 여 꿀벌의 다른 뇌 영역에 PLC 활동을 감지 하 고 이후에이 조직에 PLC에 edelfosine의 네오 마이 신 억제 효과 테스트 하는 자세한 프로토콜을 제시. 프로토콜 기본 조작만 필요, 그것은 꿀벌 다른 사회적 작업에 할당 된 다른 조직에서 PLC 활동 또는 뇌의 연구에 적용할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
단백질 활동의 생화학 검사는 심히 중요 한 효소의 활동 억제제, 기판 등 다양 한 분자에 의해 영향을 함께 따라서, 변경할 수 있습니다 때문에 두뇌에 신호 분자를 이해 하기 위한 동물 행동 (예, 학습 및 메모리)5. 꿀벌 연구, 순환 앰프 종속 단백질 키 니 아 제 A, 순환 GMP 종속 단백질 키 니 아 제, PKC, phosphorylated CaMKII, 및 adenylate 있고 같은 효소에 따라 다양 한 두뇌 지구에?…
開示
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
그림 4B – 4 D Suenami 외 에서 수정 된 생물학 오픈의 허가 함께 24 . 저자는 허가 대 한 게시자에 감사. 이 작품은 쇼타 Suenami와 료 미야자키 인간 프론티어 과학 프로그램 (RGY0077/2016)에 의해 지원 되었다.
Materials
| Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23227 | The reagent kit for measurement of protein concentration |
| Pierce Bovine Serum Albumin Standard Ampules 2mg/mL | ThermoFisher Scientific | 23209 | The standard samples used in BCA assay |
| Paraffin wax | GC | 13B1X00155000141 | Dental wax used as dissection stage |
| Insect pin | Shiga | No. 0 | Stainless, solid head |
| PLCglow | KXT Bio | KCH-0001 | A fluorogenic substrate of PLC |
| 384-well microplate | Corning | 4511 | Low-volume, round-bottom plate in black color |
| Gemini EM microplate reader | Molecular Devices | ||
| Edelfosine | Santa Cruz Biotechnology | sc-201021 | pan-PLC inhibitor |
| Neomycin sulfate | Santa Cruz Biotechnology | sc-3573 | pan-PLC inhibitor |
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